إن مستقبلات P2X7 متعددة الاستخدامات للغاية وتعمل بشكل مختلف اعتمادًا على كمية الحاضرة المهذّبة. وبهذه الطريقة، P2X7 لديه وظائف مختلفة ويمكن تنظيم علم وظائف العديد من النظم المختلفة. يسمح هذا البروتوكول للتحقيق في الوظائف الرئيسية الثلاث لمستقبلات P2X7.
وهو أسلوب سريع وقابل للاستنساخ وقابل للقياس الكمي لفهم وظيفته. تركيزنا على كيفية P2X7 المستقبلات يمكن أن تعدل في الخلايا السلف العصبي. ومع ذلك يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لتناسب أي نوع الخلية.
يمكن للطلاب الذين قرأوا ما يكفي من الأدب قبل محاولة هذا الإجراء تعلم أنه في يوم واحد فقط وتكون قادرة على تشغيل هذا وحده بعد اثنين أو ثلاثة محاولات. ابدأ هذا الإجراء عن طريق الحصول على خلايا السلف العصبي من المنطقة الفرعية والقباض من الفئران البالغة كما هو موضح في بروتوكول النص. الحفاظ على الثقافات في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
يجب أن تتشكل الخلايا العصبية بعد سبعة إلى 10 أيام هو مرور صفر ثقافة المنطقة دون البطينية وبعد 15 إلى 20 يوما في ثقافة قرن آمون. بعد المرحلة الأولى من مرور صفر ثقافة، مرور كل سبعة إلى 10 أيام حسب الضرورة باستخدام مجلس الوزراء السلامة البيولوجية والممارسات القياسية لثقافة الأنسجة. مرور المجالات عندما تصل إلى 150 إلى 200 ميكرون في القطر.
جمع المجالات والمتوسطة في أنبوب 15 ملليلتر وتدور بسرعة منخفضة لمدة دقيقتين. إزالة المتوسطة واحتضان الخلايا مع كاشف تفكك لمدة سبع إلى 10 دقائق في 37 درجة مئوية اعتمادا على حجم المجالات. وأخيراً، عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيتات أو عداد الخلايا التلقائي.
نعلق الخلايا المفردة في ملليلتر واحد من وسيط الصوديوم الخالي من الكالسيوم. ثم تحميل الخلايا مع اثنين من ninigrams لكل ملليلتر من صبغة مؤشر الكالسيوم و 10 ميكرولترات من 5٪ حمض pluronic. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
اغسل الخلايا بإضافة ثلاثة إلى خمسة ملليلترات من وسط الصوديوم الخالي من الكالسيوم والطرد المركزي بلطف. إزالة فائقة وإعادة تعليق الخلايا في وسط الصوديوم خالية من الكالسيوم، وغسل مرة ثانية. إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الكالسيوم خالية من المتوسط.
ثم ضع الخلايا على الجليد والسماح لهم دي استريفي لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا مرة أخرى عن طريق إضافة ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من البوتاسيوم المتوسطة وrrifuging المركزي كما كان من قبل. بعد إعادة تعليق الخلايا في وسط البوتاسيوم، eliquate لهم في فرز الخلايا المنشطة الفلورية أو أنابيب FACS بتركيز مليون خلية لكل 500 ميكرولترات لكل أنبوب FACS.
ضع أنابيب FACS على الجليد حتى تصبح الخلايا جاهزة للتحليل. لا تترك الخلايا على الجليد لفترة طويلة ولكن تبدأ في إجراء الفحص في أقرب وقت ممكن. لبعض العينات، قبل احتضان الخلايا مع مثبطات مستقبلات P2X7 محددة كما هو موضح في بروتوكول النص.
قبل بضع دقائق من تشغيل العينة الأولى، إضافة كلوريد الكالسيوم إلى تركيز نهائي من ملليمتر واحد ووضع الأنبوب في حمام الماء 37 درجة مئوية لاسترداد. إسقاط ستيرر مغناطيسي صغير نظيف في أنبوب FACS ووضع الأنبوب في وحدة الوقت التي ترتبط بحمام الماء 37 درجة مئوية الدورة للسيطرة على درجة حرارة العينة. حدد سرعة تحريك منخفضة لضمان حركة العينة دون إدخال تأثير دوامة.
ضع إبريق الماء ومحول الأنبوب على منصة العينة واغلق ذراع ذراع ذراع جهاز FACS. بدء عملية الحصول على العينة وتشغيل العينة لمدة ثلاث دقائق في حوالي 1,000 الأحداث في الثانية. في علامة 40 ثانية، بسرعة إزالة الأنبوب وإضافة ناهض P2X7.
إما واحد ملليمتر ATP أو 300 BzATP ميكرومولار. ثم استبدال أنبوب لمواصلة الاستحواذ. في حين أن العينة الأولى هي تسجيل، وإعداد العينة الثانية مع كلوريد الكالسيوم.
وضعه في 37 درجة مئوية للسماح بوقت كاف للخلايا للاحماء قبل التحليل. بمجرد الانتهاء من العينة الأولى، قم بتنظيف المداهمة عن طريق تشغيل عينة مياه. ثم يمكن أن يبدأ الحصول على العينة الثانية كما كان من قبل.
دائماً تنظيف المداهمة بين العينات. إنشاء تعليق خلية واحدة كما كان من قبل وحفظ بضعة ملليلترات من المتوسطة مكيفة. استخدم الوسيلة لإعادة تعليق الخلايا بتركيز مليون خلية لكل 100 ميكرولترات لكل أنبوب FACS ووضع الخلايا على الجليد حتى تصبح جاهزة.
قبل تشغيل المقايسة، أضف 900 ميكرولترات من وسيط البوتاسيوم لحجم نهائي من ملليلتر واحد. ضع الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للتعافي. إذا كان ذلك ممكنا، قبل احتضان الخلايا مع العلاجات بما في ذلك مثبطات P2X7 محددة.
مباشرة قبل تشغيل المقايسة، إضافة 25 بروميد ethidium ميكرومولاري إلى أنبوب FACS. ثم إضافة الستيرر المغناطيسي، ووضع الأنبوب على آلة FACS وتبدأ في الحصول على ما كان عليه من قبل. للحث على تكوين المسام في غشاء الخلية، إضافة واحد المليمولار ATP أو 100 BzATP ميكرومولار 40 ثانية بعد بدء عملية الشراء.
تشغيل العينات في حوالي 1,000 الأحداث في الثانية لمدة ست دقائق. في حين أن العينة الأولى قيد التشغيل، خذ العينة الثانية من الجليد ووضعها في حمام الماء 37 درجة مئوية للسماح بوقت كاف للخلايا لاسترداد قبل التحليل. بمجرد الانتهاء من عملية الحصول على العينة الأولى وتنظيف المداهمة ، يمكن وضع العينة الثانية على الجهاز لبدء التسجيل.
نحن تعليق الخلايا الفردية في المتوسط مكيفة و ايليكوتي لهم في أنابيب FACS بتركيز ما لا يقل عن مليون خلية لكل 100 ميكرولترات لكل أنبوب FACS. تمييع الخلايا إلى تركيز نهائي من مليون خلية لكل ملليلتر مع متوسط الصوديوم ووضع الخلايا على الجليد حتى يتم إجراء التحليل. استخدام واحد ميكرون واسعة G-الخرز كأهداف بالمعة لمقايس البلعمة في الوقت الحقيقي.
قبل تشغيل العينة الأولى، نقل الخلايا إلى حمام الماء 37 درجة مئوية واحتضانها لمدة سبع إلى 10 دقائق تقريبا للسماح للخلايا للتعافي. إضافة أي العلاجات التي تتطلب ما قبل الحضانة إلى الأنابيب الخاصة بهم بما في ذلك ATP, المؤسدة ATP, السيتوكيليسين D و 4٪ شبهformaldehyde. لا يلزم الحضانة قبل المصل 5٪ من الدم.
إذا تمت إضافة العلاجات في نفس الوقت تقريبًا ، يمكن تشغيل العينات على التوالي بينما يستمر الآخرون في الاحتضان لأن أوقات الحضانة الخاصة بهم تختلف. ضع العينة على مقياس السيتا مع المُرَكِّر المغناطيسي وابدأ عملية الحصول على العينة كما كان من قبل. إزالة أنبوب عينة من الجهاز 15 إلى 20 ثانية بعد بدء عملية الاستحواذ وإضافة خمسة ميكرولترات من الخرز YG غير مخفف.
إعادة عينة أنبوب FACS إلى الصك ومواصلة عملية الاقتناء. تشغيل العينات لمدة سبع إلى ثماني دقائق في حوالي 1,000 الأحداث في الثانية الواحدة. في حين أن العينة الأولى تعمل، تأخذ العينة الثانية من الجليد ووضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية للسماح بوقت كاف للخلايا لاسترداد قبل التحليل.
مرة واحدة في العينة الأولى في الانتهاء وتم تنظيف المداهمة، تبدأ اكتساب على العينة الثانية. عندما رسم مع مرور الوقت، كان تدفق الكالسيوم مماثل بشكل عام في خلايا السلف العصبية في المنطقة العصبية في منطقة فرس النهر والخلايا الفرعية الطورين. تمت إضافة ناهضين عند العلامة 42.
ينشط BzATP بسرعة مستقبلات P2X7 ، ويفتح قناة أيون ويسمح بتدفق الكالسيوم الذي يرتبط بفلوفو -8 وفلورسيس. تطبيق ATP يؤدي عموما في تدفق الكالسيوم أكثر تدرجا. لديها تقارب أقل لP2X7 بالمقارنة مع BzATP وسوف يؤدي أيضا إلى تنشيط مستقبلات G-البروتين إلى جانب.
بعد تطبيق ATP و BzATP من ناهض، تحليل الوقت تدفق عملية القياس يلتقط بروميد الإتيهيديوم دخول الخلايا من خلال مسام عبر مبروم في الوقت الحقيقي. وقد تم تخفيف هذا التأثير من قبل مثبط P2X7 محددة. وتوضح مقايسات استجابة تركيزات ATP آثار التركيز المضروب على تكوين مسام P2X7 باستخدام التغير في الفلور البروم الإثيديوم بمرور الوقت.
هنا P2X7 مستقبلات تشارك البلعمة التي تنطوي عليها فرس النهر والخلايا السلف العصبية المنطقة دون البطينية هو إظهار في الوقت الحقيقي. تم تأسيس مستويات البلعوم غير المثبط من الخرز YG اللاتكس كتحكم إيجابي. ATP منعت البلعوم من الخرز YG إلى نفس الحد الذي مثبطات غير محددة, وهي تثبيت شبه شكلي و actin البلمرة المانع سيتوكيليسين D.5٪ المصل ألغت جميع البلعوم الفطرية.
الحفاظ على مجموعة خلايا صحية وتقليل الوقت على الجليد أمر حيوي للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ. يمكن تقليل التباين باستخدام نفس الدفعة من ATP لمحسب الخلية بأكملها. لدينا نتيجة توقيت تدفق قياس الاستئصالي أظهرت هنا هو الرسالة الوحيدة التي يمكن أن تستمر تحديد كميات للتدفقات والتغييرات في السكان الفرعية المستهدفة.
طريقة بديلة هي المجهر الفلورسنت وقارئ طبق الفلورسنت. ومع ذلك، لا يمكن قياس هذه الطريقة باستمرار التغيرات الفلورية بسبب برنامج تقارب الفلورسنت. P2X7 هو فريد متعدد الوسائط.
اكتشاف التعبير عن ذلك على خلية من الاهتمام فتح سلسلة من الأسئلة الفريدة للمحققين لاستكشاف.
