P2X7 reseptörleri son derece çok yönlüdür ve mevcut agonist miktarına bağlı olarak farklı işlev görür. Bu şekilde, P2X7 farklı fonksiyonlar vardır ve birçok farklı sistemlerin fizyolojisini düzenleyebilir. Bu protokol P2X7 reseptörünün üç ana fonksiyonlarının araştırılmasına olanak sağlar.
Işlevini anlamak için hızlı, tekrarlanabilir ve ölçülebilir bir yöntemdir. P2X7 reseptörlerinin nöral progenitör hücrelerinde nasıl modüle edilebildiği konusuna odaklanıyoruz. Ancak bu yöntem herhangi bir hücre türüne uyacak şekilde kolayca uyarlanabilir.
Bu işlemi denemeden önce yeterli literatürü okumuş olan öğrenciler bunu sadece bir günde öğrenebilir ve iki ya da üç denemeden sonra bunu tek başlarına çalıştırabilirler. Metin protokolünde açıklandığı gibi subventriküler zonun ve yetişkin farelerin hipokampusundan nöral progenitor hücreleri alarak bu prosedüre başlayın. % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece kültürleri korumak.
Nörosferler yedi ila 10 gün sonra oluşmalıdır pasaj sıfır subventriküler bölge kültürü ve hipokampal kültürde 15-20 gün sonra. İlk geçiş sıfır kültür aşamasını takiben, biyolojik güvenlik kabini ve standart doku kültürü uygulamaları kullanılarak gerektiğinde her yedi ila 10 günde bir geçiş yapılır. Küreleri çapı 150-200 mikrona ulaştıklarında iletin.
Küreleri ve orta yı 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve iki dakika düşük hızda döndürün. Ortamı çıkarın ve kürelerin büyüklüğüne bağlı olarak 37 santigrat derecede 7 ila 10 dakika ayrışma reaktifi ile hücreleri kuluçkaya yatırın. Son olarak, hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
Tek hücreleri bir mililitre kalsiyumsuz sodyum ortamda askıya alıyoruz. Daha sonra hücreleri mililitre başına iki ninigram kalsiyum indikatör boyası ve 10 mikrolitre %5 pluronik asit ile yükleyin. Hücreleri 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Kalsiyumiçermeyen sodyum orta ve hafifçe santrifüj üç ila beş mililitre ekleyerek hücreleri yıkayın. Süpernatant çıkarın ve ikinci kez yıkama, kalsiyum içermeyen sodyum ortamda hücreleri yeniden askıya. Kalsiyumiçermeyen sodyum ortamının bir mililitresinde hücreleri yeniden askıya alın.
Sonra hücreleri buzüzerine yerleştirin ve 30 dakika boyunca esterden arındırılamasını bekleyin. Hücreleri bir kez daha 3-5 mililitre potasyum orta ve santrifüj ekleyerek yıkayın. Potasyum ortamda hücreleri yeniden askıya sonra, floresan aktive hücre sıralama veya FACS tüpleri içine FACS tüp başına 500 mikrolitre başına bir milyon hücre konsantrasyonu onları eliquate.
Hücreler analiz edilinceye kadar FACS tüplerini buza yerleştirin. Hücreleri uzun bir süre buzüzerinde bırakmayın, ancak en kısa sürede taramaya başlayın. Bazı örnekler için, metin protokolünde açıklandığı gibi P2X7 reseptöre özgü inhibitörü ile hücreleri önceden kuluçkaya yatırın.
İlk numuneyi çalıştırmadan birkaç dakika önce, bir milimonun son konsantrasyonuna kalsiyum klorür ekleyin ve tüpü kurtarmak için 37 derecelik bir su banyosuna yerleştirin. FACS tüpüne temiz bir küçük manyetik karıştırıcı bırakın ve numune sıcaklığını kontrol etmek için dolaşan 37 derece santigrat su banyosuna bağlı olan zaman modülünde tüpü yerleştirin. Girdap etkisi yapmadan numunenin hareketini sağlamak için düşük karıştırma hızı seçin.
Su sürahisini ve tüp adaptörünü numune platformuna yerleştirin ve FACS makinesinin kolu kolunu kapatın. Örnek alımını başlatın ve numuneyi saniyede yaklaşık 1.000 etkinlikte üç dakika çalıştırın. 40 saniye işareti, hızlı bir şekilde tüp kaldırmak ve P2X7 agonist ekleyin.
Ya bir milimolar ATP ya da 300 mikromolar BzATP. Sonra satın alma devam etmek için tüp değiştirin. İlk numune kayıt sırasında, kalsiyum klorür ile ikinci örnek hazırlayın.
Analizden önce hücrelerin ısınması için yeterli zaman tanımak için 37 santigrat dereceye yerleştirin. İlk numune tamamlandıktan sonra, bir su numunesi çalıştırarak alımı temizleyin. Daha sonra ikinci örneğin edinimi daha önce olduğu gibi başlayabilir.
Örnekler arasındaki alımı her zaman temizleyin. Daha önce olduğu gibi tek hücreli süspansiyon oluşturun ve koşullandırılmış ortamın birkaç mililitre kaydedin. FACS tüpü başına 100 mikrolitre başına bir milyon hücre konsantrasyonu hücreleri yeniden askıya almak ve hazır olana kadar buz üzerinde hücreleri yerleştirmek için orta kullanın.
Tahlil çalıştırmadan önce, bir mililitre son hacmi için potasyum orta 900 mikrolitre ekleyin. Tüpleri kurtarmak için 10 dakika boyunca 37 derece santigrat derece su banyosuyerleştirin. Varsa, P2X7 spesifik inhibitörleri de dahil olmak üzere tedaviler ile hücreleri ön kuluçka.
Teşbibi çalıştırmadan hemen önce, FACS tüpüne 25 mikromolar ethidium bromür ekleyin. Sonra manyetik karıştırıcı ekleyin, FACS makineüzerinde tüp yerleştirin ve daha önce olduğu gibi edinme başlar. Hücre zarında gözenekleri oluşumunu indüklemek için, bir milimolar ATP veya 100 mikromolar BzATP 40 saniye satın alma başladıktan sonra ekleyin.
Örnekleri saniyede yaklaşık 1.000 etkinlikte altı dakika çalıştırın. İlk örnek çalışırken, buzdan ikinci örneği alın ve analizden önce hücrelerin iyileşmesi için yeterli zaman tanımak için 37 derece santigrat su banyosuna yerleştirin. İlk numune edinimi tamamlandıktan ve alım temizlendikten sonra, ikinci numune kayda başlamak için makineye yerleştirilebilir.
Biz şartlı ortamda tek hücreleri askıya ve FACS tüp başına 100 mikrolitre başına en az bir milyon hücre konsantrasyonu ile FACS tüpleri içine eliquate. Hücreleri mililitre başına bir milyon hücrenin son konsantrasyonuna sodyum orta sıyla seyreltin ve analiz yapılana kadar hücreleri buza yerleştirin. Gerçek zamanlı fagositoz tahlilleri için fagositik hedefler olarak bir mikron genişliğinde G-boncuk kullanın.
İlk örneği çalıştırmadan önce, hücreleri 37 derecelik bir su banyosuna aktarın ve hücrelerin iyileşmesi için yaklaşık 7 ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. ATP, okside ATP, sitokelisin D ve%4 paraformaldehit dahil olmak üzere kendi tüplerine pre-inkübasyon gerektiren tedavileri ekleyin. %5 insan serumu için ön kuluçka gerekmez.
Tedaviler yaklaşık olarak aynı anda eklenirse, diğerleri kuluçka süreleri değiştiği için kuluçkaya yatmaktadır. Manyetik karıştırıcı ile sitometre üzerine örnek yerleştirin ve daha önce olduğu gibi örnek edinme başlatın. Satın alma başladıktan 15 ila 20 saniye sonra numune tüpünü makineden çıkarın ve seyreltilmemiş YG boncukbeş mikrolitre ekleyin.
Örnek FACS tüpünü cihaza geri verin ve satın almaya devam edin. Örnekleri saniyede yaklaşık 1.000 etkinlikte yedi ila sekiz dakika çalıştırın. İlk örnek çalışırken, buzdan ikinci örneği alın ve analizden önce hücrelerin iyileşmesi için yeterli zaman tanımak için 37 derecelik bir su banyosuna yerleştirin.
İlk numune tamamlandıktan ve alım temizlendikten sonra, ikinci numunede edinmeye başlayın. Zaman içinde çizildiğinde, kalsiyum akını genellikle hipokampal ve subventriküler zon nöral progenitor hücrelerde benzerdi. Agonistler 42.
BzATP hızla P2X7 reseptörlerini aktive, iyon kanalını açma ve flor-8 ve floresan bağlayan kalsiyum akını sağlar. ATP uygulaması genellikle daha kademeli bir kalsiyum akını ile sonuçlanır. BzATP ile karşılaştırıldığında P2X7'ye daha düşük bir yakınlığı vardır ve aynı zamanda G-protein ile birleşen reseptör aktivasyonuna neden olur.
AgonistIN ATP ve BzATP uygulamasının ardından, zaman çözümlü akış sitometrisi, transmembran gözeneklerinden hücrelere giren ethidyum bromür'ü gerçek zamanlı olarak yakalar. Bu etki P2X7'ye özgü inhibitör tarafından zayıflatıldı. ATP konsantrasyon yanıt tahlilleri zaman içinde ethidyum bromür floresandeğişim kullanarak P2X7 gözenek oluşumu agonist konsantrasyon etkilerini göstermektedir.
Burada Hipokampal ve subventriküler zon nöral progenitor hücreleri tarafından P2X7 reseptör-ilgili fagositokis gerçek zamanlı olarak gösterin. Pozitif kontrol olarak YG lateks boncuklarının inhibisyonu olmayan fagositoksis düzeyleri saptandı. ATP, YG boncuklarının fagositozunu spesifik olmayan inhibitörlerle aynı ölçüde inhibe etti, yani paraformaldehit fiksasyonu ve aktin polimerizasyon inhibitörü sitokelizin D.5%serum tüm doğuştan gelen fagositozu ortadan kaldırdı.
Sağlıklı bir hücre popülasyonu korumak ve buz üzerinde zaman azaltmak tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için hayati önem taşımaktadır. Değişkenlik, tüm hücre tsamaiçin aynı ATP grubu kullanılarak en aza indirilebilir. Burada gösterilen akış sitometrisinin zamanlanmış sonucu, hedeflenen alt popülasyondaki akışlar ve değişiklikler için belirli miktarları devam ettirebilen tek mesajdır.
Alternatif yöntem floresan mikroskop ve floresan plaka okuyucudur. Ancak, bu yöntem floresan yakınlık programı nedeniyle floresan değişiklikleri sürekli olarak ölçemez. P2X7 benzersiz multi-modal.
İlgi çekici bir hücredeki ifadesini keşfetmek, araştırmacıların keşfetmesi gereken bir dizi benzersiz soruyu ortaya çıkar.
