该协议演示了一种在单个转换步骤中引入不同位点上的多个表达盒式复用基因组编辑方法。这种用于表达单个 crRNA 阵列的克隆自由质粒组装方法，可带来快速、高效、灵活的基因组编辑方案。我们将设计野生型酵母细胞，通过引入自由基因组位上的自由异源基因来产生类胡萝卜素。
单个 crRNA 阵列由从 RNA 聚合酶自由启动子中表达的免费单个 crRNA 组成。Cas12a 在体内将 crRNA 阵列处理成单独的 crRNA。crRNA引导Cas12a到基因组DNA上的目标位点，其中Cas12a引入双链断裂。
向下的DNA片段重组，用于体内重组并整合到基因组DNA中。展示该协议的将是KlaudiaCiurkot，一个博士生。杰弗瑞·范·维克，副科学家。
布伦达·冯克，我们实验室的高级助理科学家在获得用于合成DNA多路复用基因组编辑实验的单crRNA阵列后，准备PCR扩增混合物，将阵列加载到热循环器中进行扩增。要通过电泳分析PCR产品，在5V/cm的0.8%加糖凝胶上运行样品40分钟。
用从100个10000基对的DNA片段加载DNA梯子，然后根据制造商的说明使用PCR纯化套件净化PCR产品。对于酵母转化，首先在含有20 mL酵母提取物肽葡萄糖或 YEPD 介质的100 mL烧瓶中预培养野生型酵母。第二天早上，在30摄氏度和每分钟250次的夜间孵育中，用一个计算量的隔夜培养酵母接种20mL的新鲜YESD培养剂。
将培养物放在摇晃的培养箱中，直到达到 600 纳米测量的光学密度为 1.0。通过离心收获酵母细胞。在20 mL室温脱华水中清洗酵母细胞颗粒，然后进行额外的离心。
将颗粒重新加入100微升醋酸三酯三酯-EDTA溶液中，将酵母转移到微离心管中。将五微升的单链载体DNA和一微克质粒pcSN067与酵母细胞悬浮液混合。然后将 600 微升聚乙二醇 LiAc-TE 溶液与样品混合。
在30摄氏度和450 prm的表顶热块中孵育酵母细胞和质粒30分钟。在孵化结束时，将70mL的二甲基硫化物与转化溶液混合。在 42 摄氏度的水浴中，热冲击混合物 15 分钟。
将混合物转移到 15 mL 圆形底部管中。将 10 mL 的 YEPD 添加到管中，在 30 摄氏度和 250 rpm 转速下进行过夜孵育。第二天早上，通过离心收集转化的细胞，并吸气所有，但最后200微升的上经剂。
在剩余的上因液中重新暂停转化的酵母细胞颗粒。板 150 微升的变换组合，和 150 微升的 20 倍稀释剩余的 50 微升变换混合物在 YEPD，在 YEPD 阿加板上，辅以 0.2 克每升 G418。在 30 摄氏度下 48 到 72 小时后，选择一个转化剂，在新的 YEPD agar 板上重新旋转，并辅以 0.2 g/L 的 G418。
对于第二次转换，将培养成 600 纳米 1.0 的光密度，正如刚刚证明的。并在微离心管中加入20微升细胞。离心后，将细胞颗粒重新在LiAc-TE溶液的100微升中，并加入ssDNA。
在一个单独的管中，结合单个 crRNA 阵列的一微克、用于 crRNA 阵列的线性化接收质粒的一微克、每个供体 DNA 的一微克和每个侧翼区域的一微克。然后将DNA混合物转移到有能力的酵母细胞的管中，并完成第二次转化，如第一次转化所证明的。第二天早上，通过离心收集细胞，并在一小块上经剂中重新补充颗粒。
然后板150微升的变换组合， 和150微升的20倍的转化混合物在YESD介质，到YESD阿加板补充0.2 g/L G418，和0.2 g/L诺西诺他林后48至72小时，在30摄氏度，选择一个单一的彩色转化剂重新条纹新的YESD板获得单色殖民地。要确定基因组编辑效率，请计算转化板上的彩色和白色菌落数量，并除以色菌落总数。为了创造酵母像素艺术，接种含有100 mL的YESD介质的单个500 mL摇瓶，用三种不同颜色的类胡萝卜素产生S.cerevisiae菌株，以及野生型CEN。
PK113-7D 应变。在30摄氏度下孵育培养，在250转/小时时摇晃。将每个隔夜培养的0.5 mL转移到每个管中含有0.5 mL无菌、非离子密度梯度介质的单个管中，然后通过涡流短暂地混合溶液。
将电池悬浮液转移到单个合格的储层 2 乘 3 孔。在声学液体处理仪器上使用具有流体校准设置 6RES_AQ_GPSA2 的 csv 文件，从适当的合格储层源板中发现每个 S.cerevisiae 菌株的 25 纳米光，以检测包含 50 mL YEPD 汞的 6144 孔目标微孔板。当所有油井被发现后，在30摄氏度下孵育微孔板48小时。
为了强化菌株的颜色，请将糖板在4摄氏度下储存至少72小时。盘子里出现了一张罗莎琳德·富兰克林的照片。如演示，启动子、开放读取帧、终止器和两个连续的 50 bp 连接器序列可以通过金门克隆反应组装成表达盒，并经 PCR 验证。
在PCR对单个crRNA阵列进行扩增后，单个crRNA阵列的接收质粒被线性化，如电泳确认。多路复用基因组编辑的效率可以通过转化后有色菌落的百分比以及 PCR 分析的结果来计算，这些分析结果证实了在预定基因组DNA位置的捐赠者DNA的整合。例如，从罗莎琳德·富兰克林的黑白照片开始，制作了一张四色图片和斑点列表，然后通过声学液体处理器在阿加微孔板上发现四种不同的酵母菌株，如所示，结果产生了科学家的高分辨率酵母画。
对于这种转化，请使用新鲜准备的解决方案和高质量的DNA片段。此方法还可用于将定义的删除和点突变多路复用引入基因组DNA。此外，还可以进行CRISPR调节实验。
可以修改此方法以在数组中引入多个自由 crNA，以增加可同时进行的修改数量。
