一种快速检测RNA编辑的无序列方法

RNA编辑在人类疾病中起着至关重要的作用。科学家正在药物中发现无穷无尽的应用。该协议展示了便携式温度电泳技术作为非测序方法的应用，可在RNA编辑中快速可靠地鉴定RNA修饰，而无需直接RNA测序。

使用基于微tTG电泳的方法表征四个编辑RNA片段的熔解谱与其相应的非编辑片段之间的差异。使用模式相似性评分来评估该方法的再现性。该平台能够以简单，简单且经济高效的方式检测RNA中的单基取代。

预计该分析工具将有助于分子生物学的新发现，首先识别具有不同熔融谱的基因片段，并使用基于Web的Umelt HETS工具生成预测的熔解曲线。为每个靶基因设计三对300至324个碱基对基因片段。选择未编辑或已编辑的对，该对显示螺旋度轴上熔化区域之间的最大差值，以便进一步分析。

对于微TGGE分析，通过PCR扩增合成选定的基因片段。使用DNA发电机软件设计正向和反向引物，并使用NCBI引物-BLAST工具验证引物序列。使用标准方法从编辑和未编辑基因的来源中提取总RNA。

合成相应的cDNA，制备20微升PCR反应混合物，并按照文稿所述设置PCR。然后，在250微升管中将6微升PCR产物与3微升6x凝胶上样染料混合，并用无菌水将总体积组成至12微升。将PCR产品储存在25摄氏度直至进一步使用。

要组装凝胶盒，请将顶部凝胶板夹在凝胶盒支架中的其他两个板之间以进行凝胶聚合。为了制备聚丙烯酰胺凝胶，将7.2克尿素加入50毫升管中，并溶解在10毫升无菌水中。在微波炉中加热样品20至30秒。

并让它冷却到室温。向溶液中加入三毫升5倍TBE缓冲液，2.25毫升丙烯酰胺双，75微升10倍过硫酸铵和15微升TEMED。将凝胶溶液以倾斜角度缓慢倒入凝胶盒支架中，以避免气泡。

约30分钟后，拆卸凝胶盒并清洁它们。使用具有垂直于DNA迁移方向的温度梯度设置的micro-TGGE装置。将上部和下部电泳缓冲液垫浸泡在两毫升1x TBE缓冲液中。

将凝胶盒放在水平电泳室单元中，并放置上下缓冲垫。然后将10微升PCR产物装入中间孔中，并将PCR产物的1微升装入每侧孔中。等待一分钟，连接电源，并在15至65摄氏度的线性温度梯度下提供100伏特12分钟。

运行完成后。取出暗盒并取下上部玻璃盖。将300微升10倍SYBR金染色剂倒在凝胶上。

使用安装在手掌大小的电泳设备中的蓝色LED手电筒可视化熔化曲线。重复每个电泳实验三次，以确认数据的可重复性。下载并打开微型TGGE分析仪软件。

打开包含凝胶图像的 JPEG 文件。单击镜框“按钮，然后选择凝胶图像的相应镜框。单击坐标校正“按钮并添加两个参考点。

单击添加特征点“按钮并添加采样点。然后，以微TGGE格式保存处理过的凝胶图像数据。单击示例按钮并选择搜索简单点“选项以比较两个或多个图像。

对于C-to-U RNA编辑类型，具有原始cBase的未编辑样品在链末端熔点处显示出比具有修饰U碱基的编辑样品更长的熔化模式。对于A-to-I RNA编辑类型，具有修饰G碱基的编辑样品在链末端熔点处显示出比具有原始A碱基的未编辑样品更长的熔化模式。对于反向U-to-C RNA编辑类型，具有修饰C碱基的第一个基因中的编辑样品在链的初始和结束熔点之间显示出比具有原始U碱基的非编辑样品更长的熔化模式。

然而，对于另一个基因，没有观察到类似的模式。C-to-You和A-to-I RNA编辑类型的模式相似性评分低于两种U-to-C RNA编辑类型的模式相似性评分。这种差异可能与编辑站点的相应位置有关。

uMelt HETS分析表明，C-to-U修饰会将熔化曲线沿温度轴向左移动。通过对未编辑片段和三个编辑片段的微TGGE分析计算出的模式相似性评分与使用uMelt预测的结果一致。靶基因片段的优化对于明确区分编辑和非编辑的原因至关重要。

这个过程在当前的协议中得到了简化。