杜琴是一种肌肉萎缩症，导致肌肉祖细胞过早耗尽。它是最严重的肌肉萎缩症之一。为了促进功能性肌肉再生，我们使用CRISPR/Cas9培养的基因编辑来恢复诱导多能干细胞衍生肌肉祖细胞中的营养不良素表达。
CRISPR-Cas9基因编辑具有恢复营养不良基因表达的潜力。自体 iPSC 衍生的肌肉祖细胞可以补充干细胞毛孔，修复损伤，并防止 DMD 的进一步并发症，而不会引起免疫反应。iPS细胞的不同代理进入肌原性原细胞，降低了肿瘤在 iPS 细胞中重新生成的风险。
几种疗法结合了自体诱导多能干细胞衍生的肌肉祖细胞细胞与CRISPR-Cas9的培养基因校正是有希望的Duchenne肌肉萎缩治疗策略。这项技术可用于通过基因编辑自体干细胞（包括心脏、大脑和血液疾病）来治疗许多先天性疾病。我们展示了这种方法的演示，可以给读者提供处理细胞重新编程和基因编辑的经验，这仍然是一个挑战。
在倒置显微镜下，检查受感染的小鼠胚胎干细胞的菌落。使用自墨对象标记标记菜底的菌落。涂抹润滑性克隆环以覆盖标记的细胞菌落。
在每个克隆环中加入100个0.05%的 Trypsin-EDTA 微升，并将板在37摄氏度的培养箱中放置5分钟。然后，将含有100微升移液器尖端的消化细胞转移到含有250毫升 MES 生长介质的48孔培养板中。在37摄氏度的培养箱中孵育细胞，具有5%的二氧化碳和85%的湿度。
当他们读取70%汇合，选择与生长良好的细胞的井，并添加250毫升的TVP溶液消化30分钟。然后，将细胞培养从每一个井转移到一个六厘米的盘子。重复应用克隆环和孵育多次，直到获得均匀的宿舍形克隆。
现在，通过添加一毫升的 TVP 解决方案来消化准备好的鼠标 iPSC。将细胞培养转移到涂有纤维素和明胶的24井板中，并在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育。细胞达到50%汇合后，切换到500微升新鲜培养基，每毫升多纤维素含有8微克。
然后，向小鼠 iPSCs 添加 100 微升的扁病毒颗粒溶液。在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育细胞三天。接下来，确定24小时内半杀率的布拉西丁和海格罗霉素B的最低浓度。
将每毫升布拉西丁2.5微克的介质和每毫升100微克的Hygromycin B加入到细胞中，等待三天，并选择保持粘附的细胞作为稳定受感染的细胞。用0.5毫升的TVP溶液消化选定的小鼠 iPSCs，每个井都放在一个新的24井板中，并在37摄氏度下孵育细胞30分钟，二氧化碳含量为5%。然后，将 iPSC 移液到单个细胞中，然后用细胞计数室计数细胞。
选择约150个消化的单细胞，用 MES 培养基稀释成 10 厘米的培养皿，培养在 37 摄氏度下，培养 5% 的二氧化碳。大约10天后，在倒置显微镜下，使用10个微升无菌移液器尖端来挑选单个菌落，并在96井板中将每个菌落转移到50微升的TVP溶液中。在37摄氏度下消化30分钟。
可靠的人工克隆采摘对于成功收获CRISPR/Cas9编辑的诱导多能干细胞至关重要。然后，将每个井的消化细胞转移并分成另外两个96孔培养板。在37摄氏度下孵育，直到70%的汇合。
当细胞菌落达到70%汇合时，去除96井板中的介质。将含有1%蛋白酶K溶液的25微升Lysis试剂添加到每井中，并将解酶转移到另一个96井PCR板中。用粘合密封密封 PCR 板，在 55 摄氏度的热循环器中孵育板 30 分钟，然后在 95 摄氏度下孵育 45 分钟，以熔接细胞并变性蛋白酶 K.然后，在 PCR 管中加入两个微升的脱酸酯、10 微升的 2x DNA 聚合酶预混料、7 微升无脱氧水， 和一个微升的 DMD Exon23 底板。
根据手稿启动 PCR 反应。然后，将随附 2.2 微升的加载缓冲液提供的 PCR 反应加载到 2% 的 agarose 凝胶上。以 100 至 150 伏运行凝胶 30 分钟，并在紫外线下检查凝胶。
在此协议中，设计了两个在突变Exon23侧侧的引导RNA。在 Cas9 调停的双链断裂和非同源最终连接被删除后，突变 Exon23 被删除，允许截断但功能性 Dystrophin 生产。为了避免 Trypsin 溶液的泄漏，我们需要将润滑脂均匀地涂抹到环的底部。
CRISPR/Cas9基因组编辑与贴装的 MyoD 激活系统相结合，为具有基因恢复基质祖细胞的杜尚肌肉萎缩患者提供了安全、可行和有效的自体移植策略。
