肌源性祖细胞衍生外质细胞的纯化与移植, 改善杜氏肌营养不良性小鼠的心功能

该协议提出了通过移植来自正常肌原细胞的外生细胞，过渡性地改善Duchenne肌肉营养不良小鼠心脏功能的方法。外体移植可以改善DMD小鼠的心脏功能，同时增加接受者心脏的营养不良表现。适当的外向分离、纯化和心肌内移植方法有助于外向移植的成功，以改善患有Duchenne肌肉萎缩症的小鼠的心脏功能。

MPC衍生的外体疗法可能通过外显体中显性正常肌营养不良mRNA转移来改善骨骼肌功能。本视频演示了外显体纯化、心肌内外显体传递和移植后超声心动图的新技术。超声心动图的演示将由我们实验室的技术人员严申完成。

为了开始这个程序，将500万C2C12细胞播种到15厘米培养皿中，含有20毫升完整的DMEM，含有10%FBS和抗生素。在37摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%。接下来，使用摆动桶转子在10万次G和4摄氏度的超离心FBS18小时，以准备外体耗尽的介质。

丢弃颗粒并收集上一液。当单层细胞在培养皿中达到80%的汇合时，用外显性培养基替换完整的DMEM。使用转移移液器每 48 小时从细胞培养盘收集上流水。

将管子在150倍G下离心10分钟，以取出剩余的细胞。通过 0.22 微米过滤器过滤上清液，消除任何细胞碎屑，并过滤中到超透明管。接下来，使用回转桶转子在 100，00 倍 G 和 4 摄氏度的管上超离心 120 分钟，以沉淀外体。

在PBS中重新填充含有外显颗粒的颗粒，然后用PBS填充整个超透明管。超离心这种悬浮液在100，00倍G和4摄氏度120分钟，以消除污染蛋白质。丢弃上一杯，在100微升PBS中重新暂停外显颗粒。

储存在零下80摄氏度，供将来使用。首先，用胶带固定每个肢体，将每只麻醉小鼠固定到手术平台上的上肢位置。水平在上牙下方放置 3-0 缝合线，将上颚保持到位。

接下来，在小鼠胸部左侧涂抹脱毛霜，以去除皮肤上的冷杉。使用 24 量表导管，通过口腔进行气管插管。使用啮齿动物呼吸机以每分钟 195 次呼吸的速度用室内空气为鼠标通风。

用70%酒精和10%的碘消毒皮肤。然后从左尾边缘到左窝，进行 10 到 15 毫米的斜切口。用剪刀剪小胸腔和小胸腔。

并通过第四个海岸间空间进行左胸腔。轻轻插入缩回带，将胸腔扩散到 10 毫米的宽度，注意不要损坏左肺。在此之后，使用两个直钳子去除佩里卡。

将它们拉开，并把它们放在缩回器尖端后面，以暴露心脏。使用 31 量胰岛素针将 MPC-Exo 或 PBS 在一个站点的左心室前壁中注射 MPC-Exo 或 PBS。然后，使用6-0尼龙缝合线，以关闭胸腔，胸腔肌肉和皮肤，顺序。

PBS外体移植两天后，对小鼠进行麻醉，如文本协议中所述。使用胶带将鼠标固定在超声位置，并在左胸区域涂抹预热声学凝胶。接下来，使用超声心动图评估左心室功能。

以两个维度获取左心室的准体长轴视图，然后旋转超声波探头 90 度，以获得左心室短轴视图在子宫颈肌肉水平。之后，记录M模式超声心动图图像并测量左心室端膜直径、左心室端膜收缩体积、左心室端膜体积和左心室端膜收缩体积。对于心脏测量功能，小鼠的心率应控制至少400 bpm。

从C2C12细胞分离和纯化外体后，通过透射电子显微镜分析确认其存在。透射电子显微镜图像显示了C2C12衍生外体明亮圆形囊泡的形态。西方印迹分析证实存在外显性标记，包括CD63和茨格101。

在心肌注射到mdx小鼠左心室前壁后观察到半透明水肿区，这表明注射到心肌中是成功的。然后进行肌营养不良素的免疫荧光染色，以确定心脏MPC-Exo分娩是否恢复mdx心脏中的肌营养不良蛋白表达。部分恢复肌营养不良素表达观察与膜定位在一些心肌细胞。

心脏功能在心肌分娩两天后通过超声心动图进行测量，以确定MPC-Exo的转增是否改善了mdx小鼠的心脏功能。与PBS相比，MPC-Exo治疗可以改善内壁运动，这表明MPC-Exo移植改善了mdx小鼠的心脏功能。使用31量表胰岛素针，尖端在20度左右，对于成功将大多数外显体传递到心肌中，并最大限度地利用注射外体照射心肌细胞至关重要。

按照该程序，在MPC衍生外体注射后，可以通过免疫荧光染色检测肌营养不良素表达，表明心脏MPC衍生外体分娩恢复肌营养不良蛋白表达。这项技术将为心肌病治疗铺平道路，使用外体携带治疗遗传物质，包括DNA、mRNA、lncRNA或微RNA。