果蝇梅拉诺加斯特的锡酸盐合成酶活性的色度测定

果蝇是研究线粒体功能的好模型系统。在这里，我们提出了一个协议，用于测量成人苍蝇组织中柠檬酸盐合成酶活性。该协议不需要线粒体隔离。

它快速而简单，适合测量幼虫、培养细胞和哺乳动物组织中柠檬酸盐合成酶活性。首先收集每个样本的成年苍蝇，确保收集每个基因型至少三分样本。在每个样品的 1.5 毫升试管中制备 500 微升的冰冷萃取缓冲液，内有 20 毫摩尔 HEPES、1 毫摩尔 EDTA 和 0.1%三吨 X-100。

麻醉垫上用二氧化碳麻醉成年苍蝇。要隔离胸部，请用一对钳子固定它们，然后用一把剪刀沿着胸部和腹部的边界切割，从而隔离飞腹。收集柠檬酸盐合成酶活性测定的飞胸。

立即将10只成年苍蝇的胸被转移到100微升的冰冷萃取缓冲液中，用冰上的害虫将其均匀化。在冰上均质5至10秒，让样品在冰上坐5秒钟，然后重复，直到所有组织完全均质。每个均质样品的10微升均匀度进入一个新的管，用于蛋白质含量测量，使这些管子也保持在冰上。

在每个剩余样品中加入 400 微升的冰冷萃取缓冲液，总体积为 500 微升，并上下移液器轻轻混合。对于每次反应，在新鲜准备的反应溶液的150微升中加入一微升稀释细胞解酸。通过轻轻移液彻底混合，确保避免气泡形成，然后使用板读卡器测量吸收度在412纳米每10至30秒在25摄氏度下4分钟。

将数据绘制为一段时间的吸收，然后计算曲线线性部分的斜率。最后，将反应速率或斜率除以样品蛋白浓度，使柠檬酸盐合成酶活性正常化。据推测，在果蝇肌肉中敲掉dRNF34将增加线粒体柠檬酸盐合成酶活性，而dPGC-1的击倒将扭转这种增加。

为每次测定建立了初始线性酶速率;趋势线的斜率表示最大反应速率，相当于不同基因型的最大柠檬酸盐合成酶活性。最大柠檬酸盐合成酶活性从动力学曲线计算，并由蛋白质浓度进行规范化。结果表明，飞胸的合成酶活性确实随着肌肉特异性dRNF34的击倒而增加，而增加的增强被肌肉特异性dPGC-1击倒逆转。

当样品均质时，重要的是对管子进行尖端和检查均质，以确保没有血块，并且管中的组织完全均匀。采集样品后，所有样品处理都应在冰上进行。柠檬酸盐合成酶活性测定用于量化完整的线粒体质量。

正确定量完整的线粒体质量对于评价线粒体功能非常重要。