Drosophila mitokondriyal fonksiyon eğitimi için iyi bir model sistemi olarak hizmet vermektedir. Burada yetişkin sineklerden homojen dokudaki sitrat sintaz aktivitesini ölçmek için bir protokol salıyoruz. Bu protokol mitokondri izolasyon gerektirmez.
Hızlı ve basittir ve larvalarda, kültürlü hücrelerde ve memeli dokularında sitrat sintaz aktivitesini ölçmek için uygundur. Her örnek için yetişkin sinekler toplayarak başlayın, her genotip için en az üç aylili örnekler toplamak için emin olun. Her numune için 1,5 mililitrelik bir test tüpünde 20 milimolar HEPES, bir milimolar EDTA ve %0,1 triton X-100 içeren 500 mikrolitre buz gibi ekstraksiyon tamponu hazırlayın.
Anestezi pedinde karbondioksit le yetişkin sineklerini anesthetize edin. Toraks izole etmek için, bir çift forceps ile düzeltmek ve bir makas ile toraks ve karın sınırı boyunca keserek sinek karın izole. Sitrat synthase aktivite analizi için sinek toraks toplamak.
10 yetişkin sinek tothoraxes buz gibi ekstraksiyon tampon 100 mikrolitre hemen aktarın ve buz üzerinde bir havaneli ile homojenize. Buzüzerinde 5-10 saniye homojenize ederek numuneleri soğuk tutun, beş saniye boyunca buzun üzerinde bekletin, sonra tüm dokular tamamen homojenize olana kadar tekrarlayın. Aliquot 10 mikrolitre her homojenize örnek protein içeriği ölçümü için yeni bir tüp içine, buz da bu tüpler tutarak.
Toplam hacmi 500 mikrolitre ve pipet yavaşça karıştırmak için kalan her numuneye 400 mikrolitre buz gibi çıkarma tamponu ekleyin. Her reaksiyon için, yeni hazırlanmış reaksiyon çözeltisinin 150 mikrolitresine bir mikrolitre seyreltilmiş hücre lisat ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için emin, yavaşça pipetleme tarafından iyice karıştırın, sonra 25 derece santigrat dört dakika boyunca her 10 ila 30 saniyede 412 nanometre emici ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.
Verileri zaman içinde emici olarak çizin ve eğrinin doğrusal kısmının eğimini hesaplayın. Son olarak, sitrat synthase aktivitesini normalleştirmek için reaksiyon hızını veya eğimi örnek protein konsantrasyonu ile bölün. Drosophila kasdrNF34 knockdown dPGC-1 nakavt bu artışı tersine çevirecek iken mitokondriyal sitrat sitrat aktivitesini artıracağı varsayımında idi.
Her bir töz için başlangıç lineer enzimatik oran oluşturulmuştur;eğilim çizgilerinin eğimleri, farklı genotiplerin maksimal sitrat sintaz aktivitelerine eşdeğer olan maksimal reaksiyon oranlarını temsil eder. Maksimal sitrat sintaz aktiviteleri kinetik eğrilerden hesaplandı ve protein konsantrasyonu ile normalleştirildi. Sonuçlar, sinek torakslarının sintaz aktivitesinin kaslara özgü dRNF34 nakavtı ile arttığını ve artışın kaslara özgü dPGC-1 nakavtı ile tersine çevrildiğini göstermiştir.
Numuneyi homojenize ederken, pıhtı olmadığından ve tüpteki dokuların tamamen homojenleştirildiğinden emin olmak için tüpün ucunun ucu ve homojenin kontrol etmesi önemlidir. Numune nin toplanmasından sonra tüm numune tedavileri buz üzerinde yapılmalıdır. Sitrat synthase aktivitesi testi bozulmamış mitokondriyal kütleyi ölçmek için kullanılır.
Bozulmamış mitokondriyal kütlenin doğru nicelleştirilmesi mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi için çok önemlidir.
