Drosophila는 미토콘드리아 기능을 연구하기위한 좋은 모델 시스템 역할을합니다. 여기서 우리는 성인 파리에서 조직 균주에서 구연산 합성 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 미토콘드리아의 격리를 요구하지 않습니다.
그것은 빠르고 간단하며 유충, 배양 세포 및 포유류 조직에서 구연산 합성 활동을 측정하는 데 적합합니다. 각 샘플에 대해 성인 파리를 수집하여 각 유전자형에 대해 적어도 삼중 시료를 수집하십시오. 각 샘플에 대해 1.5 밀리리터 테스트 튜브에 20 밀리머 HEPES, 1 밀리머 EDTA 및 0.1% 트리톤 X-100을 사용하여 500마이크로리터의 얼음 냉기 추출 버퍼를 준비합니다.
마취 패드에 이산화탄소로 성인 파리를 마취합니다. 흉부를 분리하려면 한 쌍의 집게로 고정하고 흉부와 복부의 테두리를 가위로 절단하여 비행 복부를 분리합니다. 구연산 신디사이저 활동 분석체에 대한 플라이 두악을 수집합니다.
성인 플라이 토렉스 10개소는 얼음냉기 추출 버퍼 100마이크로리터로 즉시 옮기고 얼음 에 유봉을 넣음하여 균질화합니다. 얼음에 5~10초 동안 균질화하여 샘플을 차갑게 유지한 다음, 5초 동안 얼음 위에 앉은 다음 모든 조직이 완전히 균질화될 때까지 반복합니다. 각 균질화 샘플의 Aliquot 10 마이크로리터는 단백질 함량 측정을 위한 새로운 튜브로 하여 이러한 튜브를 얼음에 보관합니다.
400 마이크로리터의 얼음 냉기 추출 버퍼를 남은 각 샘플에 추가하여 총 500마이크로리터와 파이펫을 위아래로 섞어 섞습니다. 각 반응에 대해, 새로 준비된 반응 용액의 150 마이크로리터에 희석된 세포 용액1마이크로리터를 추가합니다. 부드럽게 파이펫팅하여 철저히 섞어 거품 형성을 피한 다음 플레이트 판독기를 사용하여 섭씨 25도에서 4분 동안 10~30초마다 412나노미터의 흡광도를 측정합니다.
데이터를 시간이 지남에 따라 흡광도로 플롯한 다음 곡선의 선형 부분에 대한 경사를 계산합니다. 마지막으로, 반응속도 또는 경사를 시료 단백질 농도로 나누어 구연산 신디사이저 활성을 정상화한다. 드로소필라 근육에서 dRNF34의 녹다운이 미토콘드리아 구연산 신디사이저 활동을 증가시킬 것이라는 가설이 있었고 dPGC-1의 녹다운은 이 증가를 되돌릴 것입니다.
각 분석지에 대해 초기 선형 효소 비율이 설정되었습니다.추세선의 경사는 상이한 유전자형의 최대 구연산 시화 활동에 해당하는 최대 반응 속도를 나타낸다. 최대 구연성 신디사이저 활동은 운동 곡선에서 계산되고 단백질 농도에 의해 정규화되었다. 결과는 플라이 두종의 신체 활동이 실제로 근육 별 dRNF34 넉다운으로 증가하고 증가근육 별 dPGC-1 넉다운에 의해 반전되었다는 것을 입증했다.
시료를 균질화할 때, 튜브를 팁하고 균질화를 확인하여 혈전이 없고 튜브의 조직이 완전히 균질화되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 샘플 수집 후 모든 샘플 치료는 얼음에서 수행해야합니다. 구연산 신디사이저 활성 분석은 미토콘드리아 질량을 정량화하는 데 사용됩니다.
미토콘드리아 질량의 적절한 정량화는 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 매우 중요합니다.
