Дрозофила служит хорошей модельной системой для изучения митохондриальной функции. Здесь мы представляем протокол для измерения активности цитрат синтазы в ткани гомогената от взрослых мух. Этот протокол не требует изоляции митохондрий.
Он быстрый и простой, и он подходит для измерения активности цитрат синтазы в личинках, культурных клеток и тканей млекопитающих. Начните с сбора взрослых мух для каждого образца, убедившись, что собрать по крайней мере тройной образцы для каждого генотипа. Подготовь 500 микролитров ледяного буфера экстракции с 20 миллимолярной HEPES, одной миллимолярной ЭДТА и 0,1%тритон X-100 в 1,5-миллилитровой пробирке для каждого образца.
Обезболивать взрослых мух углекислым газом на анестезии площадку. Чтобы изолировать грудную клетку, исправить их с парой типсов и изолировать мухи животы, разрезая вдоль границы грудной клетки и живота с ножницами. Соберите муху грудной клетки для цитрат синтазы деятельности анализа.
Передача 10 взрослых мух грудной клетки на 100 микролитров ледяной буфер извлечения немедленно и гомогенизировать их с пестиком на льду. Держите образцы холодными, гомогенизируя в течение пяти-десяти секунд на льду, позволяя им сидеть на льду в течение пяти секунд, а затем повторять, пока все ткани полностью гомогенизированы. Aliquot 10 микролитров каждого однородного образца в новую трубку для измерения содержания белка, сохраняя эти трубки на льду, а также.
Добавьте 400 микролитров ледяного буфера экстракции к каждому оставшемуся образцу общим объемом 500 микролитров и пипеток вверх и вниз осторожно, чтобы перемешать. Для каждой реакции добавьте один микролитер разбавленной клетки лизай до 150 микролитров свежеприготовленного реакционной раствора. Тщательно смешайте, аккуратно трубы, убедившись, чтобы избежать образования пузыря, а затем использовать считыватель пластин для измерения поглощения на 412 нанометров каждые 10 до 30 секунд в течение четырех минут при 25 градусов по Цельсию.
Участок данных в качестве поглощения с течением времени, а затем рассчитать наклон для линейной части кривой. Наконец, разделите скорость реакции или наклон по концентрации белка образца для нормализации активности цитратной синтазы. Было выдвинуто предположение, что нокдаун dRNF34 в мышцах Drosophila увеличит митохондриальный цитрат синтазы деятельности в то время как нокдаун dPGC-1 бы обратить вспять это увеличение.
Для каждого анализа была установлена начальная линейная энзиматическая скорость; склоны трендовых линий представляют собой максимальные скорости реакции, эквивалентные максимальной цитратной синтазной деятельности различных генотипов. Максимальный цитрат синтазы деятельности были рассчитаны из кинетических кривых и нормализуется концентрации белка. Результаты показали, что активность синтазы мухи грудной клетки действительно увеличилось с мышцами конкретных dRNF34 нокдаун и увеличение было обращено на мышцы конкретных dPGC-1 нокдаун.
При гомогенизации образца, важно, чтобы наконечник трубки и проверить гомогенат, чтобы убедиться, что Есть нет сгустков и что ткани в трубке полностью гомогенизированы. После сбора проб все пробные обработки должны проводиться на льду. Анализ активности цитрат-синтазы используется для количественной оценки нетронутой митохондриальной массы.
Правильная количественная оценка нетронутой митохондриальной массы очень важна для оценки митохондриальной функции.
