此方法将有助于理解和执行必要的实验室技术，以确定两个微RNA在体外肺癌细胞中的活性。肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因。在这里，我们介绍从基本实验室方法到更复杂的协议的技术，如基因表达分析和抗体蛋白微RNA，专门用于识别微RNA的作用。
以下方法将帮助我们回答有关两个微RNA，微RNA143和微RNA506对调节肺癌细胞周期的影响的关键问题。我们提出了不同的实验室技术，如细胞转染、RNA提取、定量实时PCR和微RNA分析。我们希望我们的介绍将有助于成功完成这些分析。
首先，将培养的细胞安占一个足以提取RNA和蛋白质的适当烧瓶中，使用qPCR或微阵列分析进行基因表达。然后用10%的FBS和1%的青霉素链霉素补充一夜的孵化。第二天，在介质中稀释微RNA 143和微RNA 506，制备微RNA样本，每个浓度为100纳米摩尔。
从培养箱中取出烧瓶并取出介质。用 1x PBS 清洗。所有未经处理的对控将只包含与细胞的不完整介质。
用转染培养库孵化细胞6小时。6 小时后，取出介质，更换四毫升新鲜、完整的介质。24小时48小时后通过三辛化收获细胞。
接下来，在每个管中用1x PBS清洗两次，然后取出上一根。为了在以后进行RNA提取，在零下80摄氏度时冻结细胞。RNA提取是按照制造商的指示使用RNA试剂盒进行的。
首先，从零下80摄氏度的温度下取出管子，并允许解冻。加入300微升的解液缓冲液和移液器上下，以分解细胞膜。加入100%超纯乙醇的同等体积。
然后混合好，放在分开的列中。离心并拆经。添加 400 微升的洗涤和缓冲液以及离心机以去除缓冲液。
在每个样品中加入5微升DNAse 1，加入75微升VNA消化缓冲液，孵育15分钟。然后用400微升RNA制备缓冲液清洗样品。接下来，用RNA洗涤缓冲液洗两次。
现在，将无核酸酶水加入柱，离心机，然后收集RNA。测量RNA浓度。在这个阶段，可以发送两微克RNA样本用于RNA测序。
使用热循环器，根据文本部分中描述的协议准备 cDNA。使用 DNAse RNAse 无水准备前向和反向底转解决方案，浓度为 10 微摩尔。准备根据样本数检测的每个基因的主混合。
对于每个 cDNA 样品，反应量根据文本中描述的表。将每个样品放在各自的井中。对于 qPCR，准备具有 96 井板布局的 Excel 文档总是好的，以便跟踪样本。
对于每个样本和分析的基因，执行其反应的三元，或至少重复。使用透明、光学透明的塑料密封器密封塑料板。避免用手指触摸薄塑料层，因为这会产生错误信号。
快速旋转板，将所有试剂混合到井底。接下来，使用定量的实时 PCR 机运行样品板。获取 qPCR 机生成的 CT 值，并分析相关基因表达。
如本视频前面部分所述，对细胞进行转染。从每个样品中收获细胞，在单独的15毫升无菌管中进行三辛化。接下来，用1x PBS清洗细胞两次，在751G下离心5分钟，然后取出上经。
通过移液器添加 200 微升冰冷 1x PBS，重新挂起并打破调色板。加入两毫升70%的冰冷乙醇，滴到管子上，同时轻轻旋转管子来修复细胞。在室温下孵育管30分钟，并在4摄氏度内放置1小时。
从四摄氏度和离心机取出管子。加入2ml冰冷的PBS和涡流，然后通过离心去除上清液。在每个样品中加入500微升含有碘化二和核糖核酸A的1x PBS，浓度为每毫升50微克和200微克，并在室温下孵育30分钟。
将样品转移到适当的管中，防止光线，并在流动环流仪上运行。本实验是识别所有细胞周期通路蛋白的表达，通过微RNA治疗改变。根据转染部分所述程序收集蛋白质样本，使用 BCA 测定进行量化。
在实验前一小时从零下四摄氏度的温度下取下滑梯，使室温升高并去除水分。采集 70 微克蛋白质样本，根据制造商的说明准备样品幻灯片，在文本部分也分步描述。请注意，用超纯脱水正确清洗幻灯片是另一个重要步骤，因为这将有助于减少幻灯片的背景。
此外，在此实验中，直到最后一步才将示例幻灯片干涸，这一点非常关键。最后，使用微阵列机扫描幻灯片并分析数据。对微RNA处理样品进行qPCR分析，以确定CDK1、CDK4和CDK6的基因表达。
这些基因调节正常细胞和癌细胞的细胞周期，并已被作为抑制肿瘤进展的手段。数据表明，由于对微RNA143和506的治疗，这些基因的调节作用降低。来自流细胞学的细胞周期分布数据表明，由于微RNA143和506组合处理的影响，G0和G1阶段的种群数量增加，S相的种群减少。
细胞周期的特定微阵列分析检测出大约60个基因的蛋白质表达变化。表示的热图显示细胞周期进展和增殖所需的多个基因的蛋白质水平的降低调节，如CDK2、海伦1和3、RE2F1。相比之下，由其生长的抑制作用所识别的蛋白质被调高。
虽然结果为半定量，需要进一步分析，但微阵列分析提供了路径活性的快速概述。我们相信，看完这段视频后，您将能够进行基本的实验室实验，帮助您识别细胞中的微RNA活性。
