木尿造血干细胞和祖细胞和MLL-AF9驱动白血病线粒体反应氧物种的流细胞学分析

活性氧物种或ROS，是由细胞产生的高活性氧物种，影响它们的行为。虽然过量的ROS也会导致广泛的细胞破坏，在严重的情况下，细胞死亡。因此，维持ROS平衡对细胞功能和生存至关重要。

此处提出的协议侧重于测量由线粒体生成的特定类型的 ROS，主要作为活体、正常或健康的造血干细胞和祖细胞群中的代谢副产物，以及来自血癌、急性骨髓性白血病或 AML 小鼠模型的白血病细胞。该协议还可用于评估基因操作，如基因缺失或过度表达，如何影响线粒体ROS在几个健康和恶性造血种群。因此，可能提供有关重做状态和细胞代谢的有见地的信息。

该技术授权对原生探针进行流结计量分析，以监测活体恶性造血干细胞和祖细胞子群中的线粒体ROS生产。该协议非常简单，可以在几个小时内完成。此外，它适用于活细胞分析，并允许区分和分析线粒体ROS在干细胞群体在骨髓，使用染色的表面标记。

在从野生紧绷小鼠和白血病MLL-AF9小鼠身上采集单核骨髓细胞后，根据手稿，将200微升细胞悬浮到9个单色控制管中。将剩余的细胞分成其他实验管，每个细胞200微升。然后放入离心机中，分别放置两个包含骨髓细胞和白血病细胞的实验管，以及一个控制管。

在300次G下离心5分钟。接下来，根据制造商的说明，将上一代细胞去掉，并在室温 F-PBS 中用活细胞/死细胞污渍重新悬浮。在冰上孵育30分钟。

之后，在三个活/死染色管中加入1毫升室温F-PBS，以及一个单一颜色控制管，用于线粒体ROS染料染色。在室温下，以 300 次 G 将管子放入离心机中，5 分钟。然后，通过重新悬浮50微克的线粒体ROS染料在13微升的DMSO中，获得5毫摩尔线粒体ROS染料库存溶液。

然后将13毫升室温F-PBS加入13微升线粒体ROS染料中，稀释至5微摩尔的最终浓度。如有必要，在溶液中加入13微升50毫摩尔维拉帕米尔，以抑制线粒体外流泵。从离心机获取管子，吸走活细胞/死细胞污渍的洗涤。

在活/死染色控制中加入 200 微升 F-PBS，并将其留在冰中，直到准备好开始分析。在每个实验管中加入200微升含有Verapamil的线粒体ROS染料染色，以及线粒体ROS染色控制管。涡流在黑暗中37摄氏度下混合和孵育10分钟。

然后向控制和实验管中加入1毫升室温F-PBS。在室温下以 300 倍 G 离心 5 分钟。吸走超吸液，再用一毫升室温F-PBS清洗细胞。

在室温下，在300倍G下再次离心5分钟。首先，为健康和白血病骨髓细胞准备两种抗体鸡尾酒。从含有健康骨髓细胞的实验管中吸出上流液，并在管中加入200微升的抗体鸡尾酒一号。

漩涡混合。还要通过添加200微升F-PBS和一微升的相应抗体来准备单色控制管。在黑暗中的冰上孵育60分钟。

从含有白血病骨髓的实验管中吸出上流液，并在管中加入200微升的抗体鸡尾酒二号。漩涡混合。在黑暗中的冰上孵育60分钟。

之后，用1毫升的冷F-PBS清洗所有管子，并在室温下以300倍G的离心机清洗5分钟。将细胞重新悬浮在500微升的冷F-PBS中。使用 40 微米过滤器将细胞悬浮液转移到每个流动细胞计管中，以排除聚集体。

首先，将一根无污渍控制管插入流式细胞仪，开始采集以补偿流式细胞仪。对其他控制管重复。之后，读取实验管以设置闸门。

要分析细胞群的大小和复杂性，首先为健康的HSPC设置前进散射面积和侧散射区图图群。按方形门按钮，从前进和侧面散射图中清除无关的碎屑。然后，在向前散射区域和高度图上，使用双鉴别器将双精度点分门出。

选择活细胞、血统低细胞和各种健康的HSPC。对于每个感兴趣的群体，分析组织图图中TRPE通道的中位荧光强度，以评估线粒体ROS信号的差异。对白血病人群重复大小分析、浇注和直方图绘制相同的过程。

从健康小鼠身上分离出的骨髓细胞被染色为活/死染料和线粒体ROS染料，随后染色的抗体识别血统标记:加CD48、C-kit、Sca-1、CD34和CD150。此外，白血病小鼠的骨髓细胞也沾染了CD45.2，以区分MLL-AF9白血病细胞与沾有CD45.1的健康接受者骨髓细胞。对健康的CD48阴性LSK和骨髓祖体之间的线粒体ROS染色的比较表明，骨髓祖体表现出明显高于线粒体ROS染色水平。

此外，与c-Kit中低白血病细胞、健康CD48阴性LSK和骨髓祖细胞相比，c-Kit高白血病祖细胞的线粒体ROS染色水平显著提高。C-Kit中低性白血病细胞，也显示比CD48阴性LSK细胞，但不是骨髓祖细胞的显著值。线粒体 ROS 染料具有高度反应性，需要适当的洗涤步骤，以确保在开始以下步骤之前去除任何多余的染料。

有几个化学上不同的ROS氟原染料，可用于本协议，以实现一点知识的重性状态在活造血细胞。这项技术在文献中得到了广泛的应用，如果与正常细胞相比，可以提供有关在白血病细胞中不同调节的代谢和信号通路有用的见解。