多路复用荧光免疫组织化学可识别多种细胞类型及其在完整形式固定石蜡嵌入组织中的位置，不仅允许细胞识别，还允许细胞到细胞的空间分析。本手册技术的主要优点是使用同一物种的多种抗体，无需交叉反应。该技术可以深入了解肿瘤微环境中免疫细胞和癌细胞的相互作用。
首次尝试此技术时，允许大约三到四天的染色，并在过程中完全跟踪每个步骤。染色过程和多路复用设计的较弱的方法对于减少常见和预期的陷阱至关重要。首先对幻灯片进行脱盐和重新加氢。
将它们放在混合烤箱中，将组织侧向上，并在 60 摄氏度下烘烤一小时。将幻灯片从烤箱中取出，让其在垂直滑动架中冷却 5 到 10 分钟。然后使用幻灯片染色组，用二甲苯处理幻灯片三次，使用 100%乙醇、95% 乙醇和 70% 乙醇处理一次，每次处理 10 分钟。
用去压水清洗幻灯片架，然后将滑梯淹没在中性缓冲形式中 30 分钟，以固定幻灯片。用水清洗幻灯片两分钟，然后进行抗原检索。将幻灯片架放入充满 pH 6.0 或 pH 9.0 抗原检索缓冲液的耐热盒中。
用塑料包装盖住盒子，用橡皮筋固定。将盒子放入旋转板边缘配备逆变器的微波炉中，以 100% 功率加热幻灯片 45 秒，然后以 20% 功率加热 15 分钟。在微摇后，让幻灯片冷却 15 到 20 分钟。
同时，准备抗体和荧光团的工作解决方案。在50毫升TBST或1X PBS中溶解0.5克牛血清白蛋白颗粒，准备原抗体稀释剂。将每个原抗体工作溶液稀释到先前确定的优化浓度。
以1至100浓度稀释荧光团稀释荧光团。在染色的最后一天，通过将三滴 DAPI 添加到一毫升 TBST 中，准备 DAPI 工作解决方案。冷却幻灯片后，将其从微波炉中取下并取下塑料包装。
用去维水洗涤两分钟，然后用 TBST 洗两分钟。洗涤后，用精细的任务擦拭和跟踪组织外方的滑轨，用疏水屏障笔擦拭和跟踪组织周围的滑轨，注意不要接触组织或让它干出来。将每个幻灯片放在加湿器室中，并在组织中加入大约四滴阻块溶液。
然后在室温下孵育幻灯片10分钟，然后进行原抗体应用。通过敲击一叠纸巾上的幻灯片侧面，从每张幻灯片上拆下阻塞溶液，并使用精细的任务擦除来移除剩余的解决方案。将幻灯片放回加湿室，加入约200微升的工作原抗体，并孵育一小时。
孵育后，将幻灯片淹没在 TBST 中两分钟，洗涤三次。从每张幻灯片上涂抹剩余的TBST，并应用大约三到四滴二级抗体。在加湿室中孵育幻灯片 10 分钟。
使用 TBST 再次清洗幻灯片，并涂抹大约 100 微升的荧光冲洗工作溶液。将幻灯片返回加湿室并孵育 10 分钟。重复 TBST 洗涤，然后根据手稿指示微波幻灯片以去除抗体。
在这个多天的染色过程中，要记住的一件重要的事情是在微摇步骤后停止，将幻灯片留在抗原检索缓冲液中过夜，确保组织和染色的完整性。用抗原检索溶液去除最后一个抗体应用，用去维水清洗幻灯片，然后每次洗涤用 TBST 洗两分钟。对抗体氟化物对的其余部分重复染色步骤，然后继续使用DAPI。
将大约 150 微升的工作 DAPI 溶液涂抹到每张幻灯片上，并在加湿室中孵育 10 分钟。孵育后，用 TBST 清洗幻灯片约 30 秒，然后安装盖滑。安装介质干燥后，在盖滑的四角涂抹清晰的指甲抛光剂，以固定其。
要分析单工，请使用 DAPI 对焦，以 250 毫秒的曝光在显微镜上对幻灯片进行图像成像。通过查看染色标记的荧光强度来评估每个单面幻灯片，并将此强度与背景进行比较。如果染色标记强度至少比背景高五倍，则在最后多路复用中使用滑动位置。
染色多路复用时，为每个抗体选择适当的顺序，并将每个荧光团分配给抗体。继续按前面所述染色多路复用，并准备一张空白幻灯片，该幻灯片接收抗体稀释剂、荧光稀释剂和 TBST，而不是原抗体、荧光或 DAPI。当准备好在显微镜上成像多路复用时，将所有通道的曝光时间设置为 250 毫秒，并使用 DAPI 对焦捕获每个图像。
然后使用分析软件通过荧光假色和病理学视图来评估每个多路复用，从而确认每个标记的特异性。为了确保多路复用测定的成功，必须进行单面测定以确定每种抗体的顺序。例如，当 Foxp3 处于阵列的第三位时，演示了使用 CD3 进行特定且坚固的染色和结肠化。
相比之下，当 Foxp3 处于第一位置时，Foxp3 的非特异性染色发生。大多数幻灯片上都存在红色颗粒和有效区域，这些区域的荧光强度较低。此检测的另一个重要步骤是 DEPI 反污，这是细胞识别和进一步分析的基础。
在具有工作和非工作 DAPI 的图像之间可以看到清晰的对比。对于多路复用检测，美丽的合成图像并不总是反映准确的污渍。CD3在可视化并显示特定染色时，CD163的病理亮场视图证明抗体是非特异性的。
最佳多路复用图像演示复合图像中的特定染色，CD3 和 CD163 特异性与病理亮场视图确认。按照此过程，可以执行自表型和空间分析计算，以进一步分析细胞与细胞的相互作用。这项技术为研究人员探索细胞和完整组织的空间模式铺平了道路，进一步增进了我们对肿瘤免疫微环境的理解。
