在 Vivo 双色 2 光子成像中,基因标记报告器细胞在皮肤中

我们的协议使我们能够实时可视化荧光标记细胞对活体动物中炎症外周刺激的反应。2-光子成像允许对活标本的深层组织进行可视化，保持其细胞及其微环境的完整性，并提供生物系统的准确表示。呼吸会随时间移动爪子，导致模糊和焦点平面丢失。

在成像之前，一定要用胶带将爪子牢牢地贴在稳定的表面上。在此，你必须能够找到合适的平面的兴趣，确保目标是接近爪子没有接触，并直接在注射部位上方。在开始该过程之前，打开多光子系统并选择 25 倍主观。

将立体机械装置放在多光子显微镜的舞台上，然后将仪器连接到麻醉输送机。将一块哑光黑纸放在设备表面，作为鼠标爪的连接点。将谐振扫描仪设置为 512 到 512 微米的固定扫描区域。

将激发激光器分别调谐为绿色和红色荧光蛋白信号的 930 和 1，100 纳米激发波长。使用 690 至 1，050 纳米的二色镜将两个激励激光器的光路径引导到单个目标，使 930 纳米调谐激发激光器反射到主扫描仪，1，100 纳米调谐激光器直接进入主扫描仪。然后将 FITC 的激光功率设置为 5%，将绿色荧光蛋白设置为 20%，并关闭顶灯。

对于体内成像，麻醉鼠标并在文本协议中概述。确认麻醉鼠标对手趾捏没有反应，然后将鼠标放在可接触到鼻锥的立体仪器中。使用黑色胶带将后爪牢牢地贴在黑纸上，同时与感兴趣区域保持近向，确保爪子的植物表面畅通无阻，朝向目标。

将大量水性润滑剂放在爪子的植物表面。触摸目标到润滑剂，在爪子和目标之间创建一列液体。使用 FITC 激发光对焦到爪子的皮层中，确认可可视化串联的二丁二暗番茄标记成纤维细胞。

用两个激光成像位于后爪植物表面下方的细胞区域。以每片约 1 微米的速度获得大约 5 到 10 Z 切片的 15 分钟时间，以建立环境的基线表示。获得基线成像后，每 20 微升 PBS 装载 25 微升玻璃汉密尔顿注射器，并装载 5 微克 FITC 联结脂聚糖或 LPS。

在不干扰爪子位置的情况下，通过植物内注射到实验后爪中来管理溶液。然后用两个激光成像位于后爪植物表面下方的细胞区域。获得 60 到 120 分钟的时间间隔约 5 至 10 Z 片，每片约 1 微米，以识别 LPS FITC 的细胞中培养中植物内吸收。

由于皮肤层内的细胞没有固有荧光，因此在野生型小鼠的植物内注射后，可以观察到后爪皮肤层中的无数细胞服用荧光标记LPS。LPS FITC 注射后，只有成纤维细胞特异性蛋白质一个正成纤维细胞表达像受体四结合，并吸收注射的蛋白质与这些细胞表达的串联二丁番茄标签的高水平共定位。相比之下，像受体一样有4个的老鼠在注射后不会结合和吸收LPS。

事实上，LPS FITC注射后，细胞轮廓可见，表明药物在细胞周围的间束流体中分散，但实际上并没有被受体所束缚。在此协议中要记住的最重要的事情是确保爪子的固定，以便视频中不会因运动或呼吸而失真。使用这个程序，可以跟踪在受伤后将荧光标记细胞的招募到一个区域，以及细胞对刺激反应的形态变化。

因此，2-Photon成像允许研究人员将基因报告小鼠和荧光标记的化合物相结合，以评估注射后活体动物发生的情况。