从单体和体内使用的Α-syr核 in 预成型纤维的产生

阿尔法-合成素预制纤维素模型正被世界各地的实验室用于研究合成疗法。虽然该模型已被许多实验室成功使用，但一些组在生成纤维并产生一致的α-核素病理学方面遇到了不一致。我们希望，这个协议，详细说明了从α-核素单体纤维的生成和体内预成型纤维的使用，可以回答研究人员对模型使用的问题。

阿尔法-四核素预制纤维素模型重述了帕金森病的主要特征，如α-核素病理学和神经退化。而且，它已被证明会导致一些动物模型的适度运动损伤。含有磷酸化α-核素的内含物的形成和神经退化的长期过程为研究人员提供了在三核酸病变过程中的不同阶段，以研究和瞄准潜在的治疗干预。

演示定制玻璃针的准备，是我们的实验室技术人员，克里斯托弗坎普。要开始这个程序，在冰上解冻α-核素单体。轻轻轻拂管子，重新使解冻的单体苏化。

离心机在15，000克和4摄氏度10分钟。然后，将上清液转移到干净的 1.5 mL 微型离心管中，并记录转移量。用1x dPBS稀释单体，最终浓度为每千升5毫克。

短暂地涡流混合，并短暂离心收集管底的所有液体。接下来，使用胶粘膜固定微型离心管盖关闭。将管子放入轨道热混合器中，在37摄氏度下放置7天，同时在1000转/小时摇晃。

在七天结束时，管内的内容应出现浑浊。首先，请安装所有必要的个人防护设备，包括手套、实验室外套和面罩。然后，在细胞培养罩中，将直径为 3.2 mm 的探头连接到转换器上。

将声波器振幅设置为 30%，将脉冲设置为 1 秒开和关闭 1 秒，将时间设置为 1 分钟。在室温下解冻纤维，同时仍在培养罩中，用无菌的 dPBS 稀释纤维。接下来，用70%乙醇打湿实验室组织，并用它来擦拭声波器的探针以清洁它。

将探头尖端淹没在双分离水和脉冲中 10 次，以进一步清洁探头。在此之后，用实验室组织擦干探头。将清洁的探针尖端放入稀释的纤维管中，然后将尖端放在管的底部。

在每次脉冲期间上下移动探头时，使用先前设定的参数对稀释的纤维进行声波化，以确保液体中的所有纤维都得到声波化。声波化后，在2000克下短暂离心一秒钟，从管子两侧收集所有液体。将探头尖端淹没在 1%SDS 和脉冲中 10 次以清洁探头。

然后，从 SDS 中取下尖端，将其淹没在双蒸馏水中，并脉冲 10 次。用用 70% 乙醇打湿的实验室组织擦拭探针，然后用干燥的实验室组织擦干。将探头从转换器上拆下并存放。

在此之后，用 1%SDS 和 70% 乙醇擦拭发动机罩中的所有表面。首先，将硅化玻璃毛细管放入玻璃针拉拔器中。打开加热元件，让附加重量拉伸加热的玻璃毛细管。

接下来，用剪刀在中间最薄的点切割拉玻璃毛细管，然后从玻璃针拉拔器上取下玻璃针。然后，使用剪刀将收缩包装管的长度切割至约 40 mm。将收缩包装滑过 10 微升斜面注射器的金属针。

使用明火加热，将收缩包装粘附在针头上，同时确保旋转针头以均匀地加热。小心地将拉玻璃针的较大一端滑过注射器的金属针。在此之后，将收缩包装管的长度切割至约 40 mm，并小心地将其滑过玻璃针，以重叠玻璃针的底座和注射器的金属针。

使用明火加热收缩包装，将玻璃针固定到金属针上。为了进一步固定针头并防止潜在的泄漏，将收缩包装管的额外长度削减至约 40 mm，并小心地将其滑过玻璃针，以重叠玻璃针的底座和注射器的金属针。使用明火加热收缩包装，将玻璃针固定到金属针上。

然后，使用剪刀修剪玻璃针，使尖端大约 8 毫米长。要测试针头，请用附着的 26 量针将 1 mL 注射器填充在蒸馏水中。从定制玻璃针注射器中取出金属柱塞，并将充满水的注射器的针头插入自定义注射器的底座。

检查玻璃针和金属针的接口有无泄漏，并确认水流稳定。然后，用蒸馏水填充微型离心管。使用定制的玻璃针注射器在蒸馏水中绘制。

检查针头以确认液体被带进注射器，并且没有气泡。如果有气泡，或者水没有拉入针头，修剪针头有助于减轻压力。在此之后，小心地将注射器与所附玻璃针一起存放在注射器盒中，直到需要手术。

使用透射电子显微镜检查确认存在长纤维。相比之下，α-核素单体是大麦可见，没有明显的形状。然后用硫夫拉文T分析确认纤维的倍数确认。

一项有代表性的测定表明，与小鼠PFF相比，dPBS和小鼠单体以相对面粉单位产生的信号较低。 人类α-核素单体产生与小鼠单体类似的信号。而人类PFF同样产生比单体更高的信号。

为了检测可读纤维的存在，进行沉积测定。在小鼠和人类PFF样品中，超生违规应比上清液含有更多的蛋白质。相比之下，来自小鼠和人类单体的大部分蛋白质存在于上清液中，而颗粒中几乎没有存在。

小鼠和人类PFF均进行声波化，以产生适当长度的PFF，用于播种α合成素内含物。对大约500个纤维进行全面检查后发现，小鼠纤维的平均长度约为44纳米。86.6% 的 PFF 尺寸为 60 纳米或更少。

然而，人类PFF的平均长度约为55.9纳米，其中69.6%的PFF长度为60纳米或更少。使用免疫基础化学确认PFF疗效的体内检查。在亚斯坦蒂格拉形成的内含物，与Lewy体具有相似的特性，因为它们含有磷酸化α突触素，含有胺化结构，与硫黄素S有污渍，并且对蛋白酶K消化具有抗药性。

声波可以使单个声波暴露在气溶胶预制纤维中。因此，应穿着适当的安全服装，并在引擎盖中进行声波化，以最大限度地降低暴露的风险。