这种方法很重要，因为没有其他协议允许在如此短的时间内分析新合成的RNA，并允许用如此短的脉冲进行脉冲追逐实验。该协议适用于蛋白质耗尽，如最佳 AID 4U 协议。主要优点是背景低。
这允许短的标签时间，通过去除几乎所有的非分核RNA。书面协议还详细介绍了许多不同类型的实验，可以执行以及如何将它们集成到此技术中。要开始此过程，在 YMM 介质中将酵母生长到 0.6 和 0.8 之间的 OD 600。
在烟罩中，将甲醇的量值达到预期样品体积的30%至50%添加到50毫升管中。紧闭管子，贴上标签，放在干冰上冷却。接下来，标记两毫升管，用于样品的长期储存，并放在冰上冷却。
将氧化锌珠添加到两个毫升管中。在冰上冷却每个样品至少一毫升的水。如果要将 S.pombe 尖峰添加到培养中，请将一个硫化 S.pombe 细胞的等分在冰上解冻。
漩涡解冻的等分，并将其添加到区域性。然后将4tU加入到10微摩尔的浓度中，并大力混合。在 15 秒到 5 分钟之间，使用硫标签。
定期采集培养的样本，直到时间课程结束。将每个样品添加到一个制备的含有甲醇的离心管中。密封每个管子，摇动彻底混合，并放在干冰上。
一旦所有样品都采集，就把它们全部放在冰上。确保样本没有冻结。如果有任何冻结，温暖他们轻轻地在手，同时不断反转。
将细胞在3000倍的g和4摄氏度的离心两分钟，使细胞产生颗粒。倒掉液体，通过上下大力移液，将颗粒重新倒入至少一毫升的冰冷水中。将悬架转移到准备好的螺钉盖管中，然后将管放在冰上。
以超过13，000倍g的速度短暂地将样品分离，以重新组装细胞。然后把它们放回冰上，取出液体。首先，在低pH值下加入400微升的AE缓冲液、40微升的SDS和800微升的苯酚。
通过涡旋 10 秒重新暂停。然后在最低功耗设置下将细胞在均质器中连续三次两分钟爆裂。将样品放在冰上两分钟，在均质脉冲之间。
将融化的细胞放在干冰上五分钟，直到凝固。接下来，使用微离心器在室温下以超过13，000倍g的速度旋转细胞，5分钟。在此之后，执行苯酚氯仿萃取和氯仿萃取，如文本协议中所述。
加入10摩尔氯化锂体积的1/3至1/2，混合沉淀RNA。以超过13，000倍g的速度离心5分钟。取出液体，然后短暂旋转样品以去除渣。
然后，用300至500微升70%乙醇清洗颗粒。将洗净的颗粒短暂离心，并清除剩余的乙醇。在65摄氏度的温度下加热，在pH7.0下将RNA颗粒重新溶解在90微升TE中。
检查完全RNA溶解后，将悬浮液转移到0.2毫升管中。首先，通过将10微升的HPDP-生物素溶液加入RNA并彻底混合，生物素解酯。在黑暗中在65摄氏度下孵育15至30分钟。
接下来，准备一个小树脂体积，大小排除列，以排除未合并的生物素。拆下柱的底部标签，松开盖子，将柱放入两毫升离心管中。以 1，500 倍 g 离心一分钟，以冲出缓冲液并丢弃流式。
然后轻轻地将 0.3 毫升 TE 添加到柱的顶部，然后使用相同的条件再次旋转。将洗涤的柱转移到新鲜 1.5 毫升管中。当样本孵育完成后，将样本添加到列的顶部。
以1，500倍g离心两分钟，将生物素化RNA样品留在管底。丢弃该列。并将 1/3 至 1/2 体积的 10 摩尔氯化锂添加到含有样品的管中。
混合以重新沉淀RNA。首先，在200微升DEPC处理水中重新溶解RNA。测量RNA浓度，并计算每个样品的体积，这些体积将给所有样品提供同等数量的RNA。
将少量RNA加入到新鲜管中，并将DEPC处理的水加回200微升的总体积。当样品处于室温时，加入25微升10 x NaTM缓冲液、25微升1摩尔磷酸钠和2.5微升10%SDS。彻底混合，在大约 100 倍 g 下轻轻离心，时间少于 30 秒。
为每个样品准备两毫升珠缓冲液，使用一个 x NaTM 缓冲液、0.1 摩尔磷酸钠和 0.1%SDS。将50微升的链球菌珠加入低保留1.5毫升的管子中。将管子放在磁架上，等待珠子沉淀。
然后，通过吸气去除液体。要清洗珠子，加入200毫升珠缓冲液和涡流，直到珠粒完全重新暂停。以大约 100 倍 g 离心管，最长为 5 秒。
将管子放在磁架中，让磁珠被磁铁捕获。如果有少量样品，通过吸气去除液体。从液体中倒掉，如果有很多样品，则吸气。
块与200微升珠缓冲液，10微升糖原和2.5微升tRNA。在室温下孵育20分钟，同时以中等速度在结束结束。在此之后，取出液体并再次清洗，如文本协议中所述。
将珠子重新在样品中重新储存，并在室温下孵育30分钟，同时旋转。在此孵育过程中，为每个样品准备一个1.5毫升的新鲜管。在pH 5.3和20微克糖原下加入1/10体积的三摩尔醋酸钠。
以大约 100 倍 g 离心三秒钟。从珠子上取出未绑定的RNA，然后像文本协议中概述的洗涤它们。为了使RNA变好，在珠子上加入50微升新鲜准备好的0.7摩尔β甲醇。
在涡旋和离心后，将泥浆放在磁架中。将含有溶液的RNA移入准备好的1.5毫升离心管中。像前面描述的那样， 再次被埃鲁特。
然后，将样品放回磁架中，从洗出的RNA中去除残留的珠子，将液体转移到新鲜、低结合的0.5毫升离心管中。混合样品。然后加入2.5卷乙醇沉淀nsRNA。
混合和孵育后，离心机以至少13，000倍的g和4摄氏度的速度进行20分钟。此处显示了使用此协议回收的 snRNA 的典型产量。请注意，时间点零的RNA回收是从较长时间点恢复的非常小部分，只有0.3微克的RNA从大约300亿个细胞中恢复。
然而，在贴标签仅仅30秒后，从相同数量的细胞中收集的RNA数量就超过两倍。在生物分析器踪迹中，我们的RNA前体可被视为接近1000个核苷酸的峰值，以及1，700至1，800个核苷酸的双峰。随着硫化的继续，这些中间体的丰度增加。
然后进行硫化，从硫标记开始15秒的间隔采集样品，并监测ACT1RNA转录本的处理。从前 mRNA 和 lariats 中可以看到，即使只需 15 秒的标签，也生成了这种预 mRNA 和 lariats。大约45秒到1分钟后，拉里亚特和mRNA前的数量达到平衡，这些RNA物种中，尽可能多的通过转录而创造的，就像通过拼接处理掉一样。
最困难的步骤是那些涉及珠子，洗涤，和阻塞。小心不要丢失珠子，或让珠子晾干。一旦你纯化了新合成的RNA，你可以使用任何传统的RNA分析程序。
建议您在生物分析器或类似产品上运行RNA。之后，我们通常使用QPCR和RNA-Seq来分析RNA。该方法是分析RNA处理动力学的理想之选。
最危险的步骤是那些在RNA提取中使用苯酚和氯仿的步骤。每次在未密封的容器中使用这些化学品时，请戴上防烟罩，并穿戴适当的防护服、实验室外套和手套。特别注意螺丝帽管的螺纹中没有氧化锌珠，因为这将导致泄漏。
