Étiquetage métabolique extrêmement rapide et spécifique de l'ARN In Vivo avec 4-Thiouracil (Ers4tU)

Cette méthode est significative parce qu’aucun autre protocole ne permet d’analyser l’ARN nouvellement synthétisé en si peu de temps, et de permettre des expériences de chasse aux impulsions avec une impulsion aussi courte. Ce protocole fonctionne bien avec l’épuisement des protéines, comme le protocole Best AID 4U. Le principal avantage est que l’arrière-plan est faible.

Cela permet les courts délais d’étiquetage, en enlevant presque tout l’ARN non thethiolated. Le protocole écrit détaille également de nombreux types d’expériences qui pourraient être effectuées et comment les intégrer dans cette technique. Pour commencer cette procédure, faire pousser la levure dans le milieu YMM à un OD 600 entre 0,6 et 0,8.

Dans une hotte de fumée, ajouter un méthanol équivalent à 30 à 50 % du volume prévu de l’échantillon à un tube de 50 millilitres. Fermez bien les tubes, étiquetez-les et placez-les sur de la glace sèche pour les refroidir. Ensuite, étiquetez deux tubes millilitres pour le stockage à long terme des échantillons et placez-les sur la glace pour refroidir.

Ajouter les perles de zirconia aux deux tubes millilitres. Refroidir au moins un millilitre d’eau par échantillon sur la glace. Si un pic de S.pombe doit être ajouté à la culture, placez un aliquot de cellules thiolées de S.pombe sur la glace pour décongeler.

Vortex l’aliquot décongelé et l’ajouter à la culture. Ajouter ensuite 4tU à la culture à une concentration de 10 micromolaires et mélanger vigoureusement. Thio-label pour une durée comprise entre 15 secondes et cinq minutes.

Prélevez des échantillons de la culture à intervalles réguliers jusqu’à la fin du cours du temps. Ajouter chaque échantillon à l’un des tubes de centrifugeuse préparés contenant du méthanol. Sceller chaque tube, secouer pour bien mélanger et placer sur la glace sèche.

Une fois que tous les échantillons ont été prélevés, placez-les tous sur la glace. Assurez-vous qu’aucun des échantillons n’a gelé. S’il y en a congelés, réchauffez-les doucement dans la main tout en les inversant constamment.

Centrifuger les cellules à 3000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant deux minutes pour pelleter les cellules. Versez le liquide et réutilisez la pastille dans au moins un millilitre d’eau glacée en coulant vigoureusement de haut en bas. Transférer la suspension dans le tube de bouchon à vis préparé et placer le tube sur la glace.

Centrifugez brièvement les échantillons à une vitesse supérieure à 13 000 fois g pour re-pelleter les cellules. Ensuite, placez-les de nouveau sur la glace, et retirez le liquide. Tout d’abord, ajoutez 400 microlitres de tampon AE, 40 microlitres de SDS et 800 microlitres de phénol à faible pH.

Resuspendez en tourbillonnant pendant 10 secondes. Puis lyse les cellules dans un homogénéiseur pendant trois éclats de deux minutes au réglage de puissance le plus bas. Laissez les échantillons sur la glace pendant deux minutes entre les impulsions d’homogénéisation.

Placer les cellules lysées sur la glace sèche pendant cinq minutes jusqu’à ce qu’elles se solidifient. Ensuite, utilisez une microcentrifugeuse pour faire tourner les cellules à une vitesse supérieure à 13 000 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Après cela, effectuer l’extraction du chloroforme phénol et l’extraction du chloroforme tel que décrit dans le protocole de texte.

Ajouter entre 1/3 et 1/2 du volume de 10 chlorure de lithium molaire et mélanger pour précipiter l’ARN. Centrifugeuse à une vitesse supérieure à 13 000 fois g pendant cinq minutes. Retirez le liquide et re-faites tourner brièvement l’échantillon pour enlever la lie.

Ensuite, lavez la pastille avec 300 à 500 microlitres de 70% d’éthanol. Centrifugez brièvement la pastille lavée et retirez le reste de l’éthanol. Dissoudre à nouveau la pastille d’ARN dans 90 microlitres de TE à un pH 7.0 en chauffant à 65 degrés Celsius tout en secouant.

Après vérification de la solubilisation complète de l’ARN, transférez la suspension dans un tube de 0,2 millilitre. Pour commencer, biotinylate en ajoutant 10 microlitres de solution HPDP-biotine à l’ARN et mélanger soigneusement. Incuber dans l’obscurité à 65 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes.

Ensuite, préparez un petit volume de résine, colonne d’exclusion de taille pour exclure la biotine non incorporée. Retirez l’étiquette inférieure de la colonne, desserrez le bouchon et placez la colonne dans un tube de centrifugeuse de deux millilitres. Centrifugeuse à 1500 fois g pendant une minute pour vider le tampon et jeter le flux à travers.

Ajouter ensuite délicatement 0,3 millilitres de TE au sommet de la colonne et tourner à nouveau en utilisant les mêmes conditions. Transférer la colonne lavée dans un tube frais de 1,5 millilitre. Lorsque l’incubation de l’échantillon est terminée, ajouter l’échantillon en haut de la colonne.

Centrifugeuse à 1500 fois g pendant deux minutes, laissant l’échantillon d’ARN biotinylated au fond du tube. Jetez la colonne. Et ajouter 1/3 à 1/2 volume de chlorure de lithium molaire de 10 molaire au tube contenant l’échantillon.

Mélanger pour précipiter à nouveau l’ARN. Tout d’abord, dissoudre l’ARN dans 200 microlitres d’eau traitée par le DEPC. Mesurez la concentration d’ARN et calculez les volumes pour chaque échantillon qui donneront des quantités égales d’ARN pour tous les échantillons.

Ajoutez cette quantité d’ARN à un tube frais et ajoutez de l’eau traitée par DEPC jusqu’à un volume total de 200 microlitres. Lorsqu’un échantillon est à température ambiante, ajouter 25 microlitres de tampon de 10 x NaMC, 25 microlitres d’un phosphate de sodium molaire et 2,5 microlitres de 10 % de SDS. Bien mélanger et centrifugeuser doucement à environ 100 fois g pendant moins de 30 secondes.

Préparez deux millilitres de tampon de perles pour chaque échantillon avec un tampon x NaTM, 0,1 phosphate de sodium molaire et 0,1 %SDS. Ajouter 50 microlitres de perles de streptavidine à un tube de 1,5 millilitre à faible rétention. Placez le tube sur la grille magnétique et attendez que les perles se déposent.

Ensuite, retirez le fluide par aspiration. Pour laver les perles, ajouter 200 millilitres de tampon de perles et de vortex jusqu’à ce que la pastille de perles soit entièrement résuspendue. Centrifuger le tube à environ 100 fois g pendant un maximum de cinq secondes.

Placez le tube dans la grille magnétique pour permettre aux perles d’être capturées par l’aimant. Retirez le liquide par aspiration s’il y a un petit nombre d’échantillons. Verser le liquide, puis aspirer s’il y a beaucoup d’échantillons.

Bloc avec 200 microlitres de tampon de perles, 10 microlitres de glycogène, et 2,5 microlitres d’ARN. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes tout en tournant fin sur fin à vitesse modérée. Après cela, retirez le liquide et lavez-le à nouveau, comme indiqué dans le protocole de texte.

Resuspendez les perles dans l’échantillon et incubez à température ambiante pendant 30 minutes pendant la rotation. Pendant cette incubation, préparer un tube frais de 1,5 millilitre pour chaque échantillon. Ajouter 1/10 volume de trois acétate de sodium molaire au pH 5,3 et 20 microgrammes de glycogène.

Centrifugeuse à environ 100 fois g pendant trois secondes. Retirez l’ARN non lié des perles et lavez-les comme indiqué dans le protocole texte. Pour élucider l’ARN, ajouter 50 microlitres de mercaptoéthanol bêta molaire fraîchement préparé 0,7 molaire aux perles.

Après le vortex et la centrifugation, placez la boue dans la grille magnétique. Pipette l’ARN contenant la solution dans les tubes préparés de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Elute une fois de plus comme décrit précédemment.

Ensuite, placez l’échantillon dans la grille magnétique pour enlever les perles résiduelles de l’ARN éduqué et transférer le liquide dans un tube de centrifugeuse frais et bas de 0,5 millilitre. Mélanger l’échantillon. Et puis ajouter 2,5 volumes d’éthanol pour précipiter nsRNA.

Après le mélange et l’incubation, centrifugeuse à une vitesse d’au moins 13 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Les rendements typiques du snRNA récupéré à l’aide de ce protocole sont indiqués ici. Notez que la récupération de l’ARN au point zéro est une très petite partie de celle récupérée à partir de points de temps plus longs avec seulement 0,3 microgrammes d’ARN récupérés à partir d’environ 30 milliards de cellules.

Après seulement 30 secondes d’étiquetage, cependant, plus de deux fois plus d’ARN est recueilli à partir du même nombre de cellules. Dans la trace de bioanalyse, nos précurseurs d’ARN peuvent être considérés comme un pic proche de 1000 nucléotides et un doublet de pics à 1700 à 1800 nucléotides. L’abondance de ces intermédiaires augmente à mesure que la thiolation se poursuit.

La thiolation est ensuite effectuée avec des échantillons prélevés à intervalles de 15 secondes à partir du début de l’étiquetage thio et le traitement de la transcription de l’ARN ACT1 est surveillé. Comme on peut le voir avant l’ARNm et les lariats sont générés même après seulement 15 secondes d’étiquetage. Après environ 45 secondes à une minute, la quantité de lariats et de pré-ARNm atteint l’équilibre avec autant de ces espèces d’ARN créées par transcription que sont traitées par épissage.

Les étapes les plus difficiles sont celles impliquant les perles, le lavage et le blocage. Veillez à ne pas perdre les perles ou à les laisser sécher. Une fois que vous avez purifié l’ARN nouvellement synthétisé, vous pouvez utiliser n’importe quelle procédure traditionnelle d’analyse d’ARN.

Il est recommandé d’exécuter l’ARN sur un bioanalyseur ou similaire. Après cela, nous utilisons normalement QPCR et RNA-Seq pour analyser l’ARN. Cette méthode s’est avérée idéale pour analyser la cinétique du traitement de l’ARN.

Les étapes les plus dangereuses sont celles utilisant le phénol et le chloroforme dans l’extraction de l’ARN. Chaque fois que vous utilisez ces produits chimiques dans un contenant non scellé, faites-le dans une hotte fumigène et portez des vêtements de protection appropriés, un manteau de laboratoire et des gants. Faites particulièrement attention qu’il n’y a pas de perles de zirconia dans le fil du tube de bouchon de vis, car cela conduira à une fuite.