이 방법은 다른 프로토콜이 이러한 짧은 시간 규모로 새로 합성된 RNA를 분석할 수 없고, 이러한 짧은 펄스를 가진 펄스 추적 실험을 허용하지 못하기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜은 Best AID 4U 프로토콜과 같은 단백질 고갈과 잘 작동합니다. 주요 장점은 배경이 낮다는 것입니다.
이것은 거의 모든 비티오탈RNA를 제거해서 짧은 라벨링 시간을 허용합니다. 또한 작성된 프로토콜은 수행 될 수있는 많은 다른 유형의 실험과 이 기술에 통합하는 방법에 대해서도 자세히 설명합니다. 이 절차를 시작하려면 YMM 중간에서 효모를 0.6에서 0.8 사이의 OD 600으로 성장시다.
연기 후드에 의도한 시료 부피의 30~50%에 해당하는 메탄올을 50밀리리터 튜브에 추가합니다. 튜브를 단단히 닫고 라벨을 붙인 다음 건조한 얼음위에 놓아 차갑게 식힙니다. 다음으로, 샘플의 장기 저장을 위해 2 밀리리터 튜브를 라벨과 얼음에 배치하여 식힙니다.
지르코니아 구슬을 두 밀리리터 튜브에 넣습니다. 얼음에 샘플 당 물 적어도 1 밀리리터를 냉각. S.pombe 스파이크를 배양에 추가하려면 얼음 위에 thiolated S.pombe 세포의 알리쿼트를 놓아 해동하십시오.
해동 된 알리 쿼트 소용돌이와 문화에 추가. 그런 다음 배양에 4tU를 첨가하여 10 마이크로몰라의 농도를 적극적으로 섞는다. 15초에서 5분 사이의 시간 동안 티오 라벨을 표시합니다.
시간 과정이 끝날 때까지 일정한 간격으로 배양 샘플을 채취합니다. 각 샘플을 메탄올이 함유된 준비된 원심분리기 튜브 중 하나에 추가합니다. 각 튜브를 밀봉하고, 흔들어서 철저히 섞고, 드라이 아이스에 놓습니다.
모든 샘플을 채취하면 모든 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 샘플중 어느 것도 동결되지 않았는지 확인합니다. 얼어 붙은 경우, 끊임없이 반전하면서 손에 부드럽게 데우십시오.
세포를 3, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 원심분리하여 세포를 펠릿합니다. 액체를 붓고, 힘차게 위아래로 파이프를 통해 적어도 1 밀리리터의 얼음 차가운 물에 펠릿을 다시 놓습니다. 서스펜션을 준비된 나사 캡 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
원심분리기는 세포를 다시 펠릿하기 위해 13, 000배 g이상의 속도로 샘플을 간략하게 분리합니다. 그런 다음 얼음에 다시 놓고 액체를 제거합니다. 먼저 AE 버퍼 400마이크로리터, SDS 마이크로리터 40개, 페놀 800마이크로리터를 낮은 pH에 추가합니다.
10초 동안 소용돌이를 통해 다시 중단합니다. 그런 다음 가장 낮은 전력 설정에서 3 2 분 버스트에 대한 균질화에서 세포를 lyse. 균질화 펄스 사이에 2 분 동안 얼음에 샘플을 둡니다.
용해 된 세포를 건조 얼음에 5 분간 놓고 고화시때까지 놓습니다. 다음으로, 마이크로센트심분리기를 사용하여 실온에서 5분 동안 13배, 000배 g 이상의 속도로 세포를 회전시킵니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 페놀 클로로폼 추출 및 클로로폼 추출을 수행합니다.
10 개의 어금니 리튬 염화물의 부피의 1/3 에서 1/2 사이를 추가하고 RNA를 침전시키기 위해 혼합합니다. 원심 분리기는 5분 동안 13배, 000배 이상의 속도로. 액체를 제거하고 샘플을 잠시 다시 회전하여 찌꺼기를 제거합니다.
그런 다음 펠릿을 70%에탄올의 300~500마이크로리터로 세척합니다. 씻은 펠릿을 원심분리하고 남은 에탄올을 제거합니다. 흔들리는 동안 섭씨 65도에서 가열하여 pH 7.0에서 90 마이크로 리터의 RNA 펠릿을 다시 용해하십시오.
전체 RNA 용해화를 확인한 후 서스펜션을 0.2 밀리리터 튜브로 이송합니다. 우선, RNA에 HPDP-비오틴 용액 10마이크로리터를 첨가하여 생체화하고 철저히 혼합합니다. 15~30분 동안 65도의 어둠 속에서 배양하세요.
다음으로, 작은 수지 볼륨, 크기 배제 열을 준비하여 비법인 비오틴을 제외한다. 컬럼의 아래쪽 태그를 제거하고 캡을 풀고 컬럼을 2밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 1, 500회 g의 원심분리기는 버퍼를 플러시하고 흐름을 폐기합니다.
그런 다음 부드럽게 0.3 밀리리터의 TE를 열 상단에 넣고 동일한 조건을 사용하여 다시 회전합니다. 세척된 컬럼을 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨냅니다. 샘플 인큐베이션이 완료되면 컬럼 맨 위에 샘플을 추가합니다.
원심분리기는 2분 동안 1, 500배 g로, 생체화 RNA 샘플을 튜브 바닥에 남깁니다. 열을 삭제합니다. 그리고 10 개의 어금니 리튬염화물의 1/3 ~ 1/2 부피를 샘플을 포함하는 튜브에 추가합니다.
혼합하여 RNA를 다시 침전시합니다. 먼저, DEPC 처리수 의 200 마이크로리터에서 RNA를 재용이한다. RNA 농도를 측정하고, 모든 샘플에 대해 동일한 양의 RNA를 제공하는 각 샘플에 대한 부피를 계산합니다.
이 양의 RNA를 신선한 튜브에 추가하고 DEPC 처리된 물을 총 200마이크로리터까지 다시 추가합니다. 샘플이 실온에 있을 때, 10 x NaTM 완충제의 25 마이크로리터, 1개의 어금니 나트륨 인산염의 25 마이크로리터 및 10% SDS의 2.5 마이크로리터를 추가합니다. 30초 이내에 약 100배 g에서 원심분리기를 부드럽게 섞습니다.
1개의 x NaTM 버퍼, 0.1 어금량 나트륨 인산염 및 0.1% SDS를 가진 각 견본을 위한 비드 버퍼의 2밀리리터를 준비합니다. 50 마이크로리터의 스트렙타비딘 구슬을 낮은 보존 1.5 밀리리터 튜브에 추가합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 구슬이 정착할 때까지 기다립니다.
그런 다음, 포부에 의해 유체를 제거합니다. 구슬을 씻으려면 비드 펠릿이 완전히 재주질될 때까지 200 밀리리터의 비드 버퍼와 소용돌이를 추가하십시오. 튜브를 약 100배 g에서 최대 5초 동안 원심분리합니다.
구슬을 자석에 의해 캡처 할 수 있도록 자기 랙에 튜브를 배치합니다. 적은 수의 샘플이 있는 경우 흡인으로 유체를 제거합니다. 많은 샘플이있는 경우 액체를 부어 다음 흡인.
200 마이크로리터의 비드 버퍼, 글리코겐 10마이크로리터, tRNA 2.5 마이크로리터로 블록하십시오. 적당한 속도로 끝을 회전시키면서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유체를 제거하고 다시 세척합니다.
샘플에서 구슬을 다시 중단하고 회전하는 동안 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 이 인큐베이션 동안 각 샘플에 대해 신선한 1.5 밀리리터 튜브를 준비하십시오. pH 5.3 및 20 마이크로그램의 글리코겐에 3개의 어금니 나트륨 아세테이트1/10 부피를 추가합니다.
3초 동안 약 100배 g의 원심분리기. 구슬에서 언바운드 RNA를 제거하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세척합니다. RNA를 엘로우기 위하여는, 구슬에 새로 준비된 0.7 어금다 베타 mercaptoethanol의 50 마이크로리터를 추가합니다.
소용돌이와 원심분리 후 슬러리를 자기 랙에 놓습니다. 제조된 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브내용액을 함유하는 RNA 파이펫. 앞서 설명한 대로 다시 한 번 엘루트.
이어서, 샘플을 자기 랙에 다시 배치하여 용출된 RNA로부터 잔류 구슬을 제거하고 유체를 신선하고 낮은 결합 0.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송한다. 샘플을 섞는다. 그리고 nsRNA를 침전시키기 위해 2.5권의 에탄올을 추가합니다.
혼합 및 인큐베이팅 후 원심분리기는 최소 13, 000배, 섭씨 4도에서 20분 동안. 이 프로토콜을 사용하여 복구된 snRNA에 대한 일반적인 수율은 여기에 나와 있습니다. 시간 점 0에서 RNA 복구는 약 300억 개의 세포에서 회수되는 RNA의 단지 0.3 마이크로그램으로 더 긴 시간 지점에서 복구된 그 중 아주 작은 부분입니다.
라벨링의 단지 30 초 후에, 그러나, 2배 이상의 RNA는 세포의 동일 수에서 집합됩니다. 생체 분석기 추적에서, 우리의 RNA 전구체는 1, 000 뉴클레오티드 및 1, 700 에서 1, 800 뉴클레오티드에서 피크의 이중에 가까운 피크로 볼 수 있습니다. 이러한 중급제의 풍부는 티올레이션이 계속됨에 따라 증가합니다.
티올레이션은 티오 라벨링의 시작과 ACT1 RNA 전사체의 처리로부터 15초 간격으로 채취되는 시료로 수행된다. 사전 mRNA와 후유리는 라벨링의 단지 15 초 후에 생성되는 것을 볼 수 있습니다. 약 45초에서 1분 정도 후에, 후유자와 전mRNA의 양은 접합에 의해 멀리 처리되는 바와 같이 전사에 의해 생성되는 이들 RNA 종의 많은 평형에 도달한다.
가장 어려운 단계는 구슬, 세척 및 차단과 관련된 단계입니다. 구슬을 잃지 않도록 주의하거나 건조하게하십시오. 새로 합성된 RNA를 정제하면 기존의 RNA 분석 절차를 사용할 수 있습니다.
생체 분석기 또는 이와 유사한 RNA를 실행하는 것이 좋습니다. 그 후, 우리는 일반적으로 Rna를 분석하기 위해 QPCR 및 RNA-Seq를 사용합니다. 이 방법은 RNA 처리의 역학을 분석하기 에 이상적이었다.
가장 위험한 단계는 RNA 추출에서 페놀과 클로로포형을 사용하는 단계입니다. 밀봉되지 않은 용기에 이러한 화학 물질을 사용할 때마다 연기 후드로 사용하며 적절한 보호 복, 실험실 코트 및 장갑을 착용하십시오. 스크류 캡 튜브의 실에 지르코니아 구슬이 없다는 것을 주의하십시오.
