通过高分辨率熔融在水稻种群中识别突变

对于技术上难以确定或成本高昂的繁殖特性（如抗病性、矿物质含量）来说，这非常有用。这是一种非常简单、经济高效、高通量的技术。首先，将四个叶盘放入 96 井 PCR 板的每个井中。

在每个井中加入50毫升缓冲液 A 溶液。将盘子冷冻在零下80摄氏度的冰柜中10分钟。然后，在室温下解冻板。

在95摄氏度下孵育10分钟。在每个井中加入50微升的缓冲B，通过涡旋混合。在 1，500 倍 g 下将板离心一分钟。

收集作为PCRDNA的上一液。首先，使用一个和PCR模板的DNA上因，以优化退火温度。在每个PCR井中加入试剂和一微升DNA上流剂。

将 PCR 管放在一个能够梯度的热块中，根据手稿调整加热程序，以确定每个目标片段的最佳退火温度。在 1%的加糖凝胶上对 PCR 产品执行电泳，以检查安胶。确定可实现目标片段特定放大的最佳退火温度。

要执行 HRM 分析，请将试剂组合在一起，包括一个 10 倍荧光染料的微升和 HRM 兼容板的每个孔中的 1 微升 DNA 上流剂。在每个板块中，包括一个野生型父性样本和一个没有DNA的阴性对照。在每一个井中加入一滴矿物油，以防止蒸发。

然后，用胶粘膜密封板，以1000倍g离心1分钟。使用优化的退火温度运行 PCR。现在，从板中去除粘合膜，并将板插入 HRM 机器。

在软件中，从文件菜单中选择"新运行"，或按屏幕顶部的"运行"按钮。指定熔体从 55 到 95 摄氏度的起始和结束温度。选择用于高分辨率熔化分析的样本，并排除类似于负对的样本。

使熔化曲线正常化，使其具有相同的开始和结束荧光。直观地确认较低的最小和较低的最高温度光标位于曲线区域中。保持三角洲 F，荧光差，在默认设置 05 的水平。

从"标准"选择列表中，选择公共与变体，然后选择正常灵敏度。选择 H12 以使用野生类型作为控件。增量 F 值大于 05 的样品被视为含有突变植物。

然后，使用CTAB方法，从突变池中提取四种植物的DNA，其融化曲线与野生类型明显不同。使用分光光度计进行定量后，使用 NanoDrop 2000 将 DNA 调整为每微升约 25 纳米的最终浓度。将 0.4 微升 PCR 底板添加到 PCR 管中的 DNA 样品中，将它们放入热循环器中，并调整程序以放大目标片段。

然后，将 PCR 产品发送给公司进行测序。桑格测序后，通过比较M2植物和野生类型之间的序列来比较分子病变。在这项研究中，HRM扫描和分析M2幼苗在OsLCT1或SPDT基因突变显示，大多数样本的融化曲线没有显著差异，与野生类型与三角洲F小于05。

突变体在温度为90至92摄氏度和81.5至83.5摄氏度时，与三角洲F大于05的HRM曲线明显不同。4，560M2幼苗的基因突变类型和位置通过测序色谱得到确认。在OsLCT1的4，304个碱基对下，一个G到A突变的异质位点被识别出来。

在OsLCT1的4，240个碱基对上出现了一个单核苷酸 A 插入，在 SPDT 的 5，948 到 5，950 基对处观察到 TTC 三核苷酸缺失。我在 HRM 分析之前优化 PCR。凝胶中的染料有点有害。

运行凝胶时，记得戴上手套。