그것은 기술적으로 어렵거나 질병 저항, 미네랄 함량과 같이 결정되기 위하여 비용이 많이 드는 특성을 사육하기 위하여 아주 유용할 것입니다. 그것은 매우 간단하고 비용 효율적이며 처리량이 높은 기술입니다. 시작하려면 4 개의 잎 디스크를 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 놓습니다.
버퍼 A 솔루션 50밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 접시를 영하 80도 냉동고에 10분간 동결합니다. 그런 다음, 상온에서 접시를 동결.
섭씨 95도에서 10분간 배양하세요. 버퍼 B 50마이크로리터를 각 웰에 넣고 소용돌이에 잘 섞습니다. 1, 500 배 g에서 1 분 동안 접시를 원심 분리합니다.
PCR에 대한 DNA로 상체를 수집합니다. 먼저, PCR 템플릿과 함께 하나의 DNA 상체를 사용하여 어닐링 온도를 최적화합니다. 시약과 각 PCR에 DNA 상수제 1편을 잘 넣습니다.
PCR 튜브를 그라데이션 가능 열 블록에 배치하고 원고에 따라 가열 프로그램을 조정하여 각 대상 단편에 대한 최적의 어닐링 온도를 결정합니다. 1%아가로즈 젤에서 PCR 제품에 대한 전기전도를 수행하여 앰플리턴을 검사합니다. 대상 조각의 특정 증폭을 가능하게 하는 최적의 어닐링 온도를 결정합니다.
HRM 분석을 수행하기 위해 HRM 호환 플레이트의 각 웰에 10배형광염과 DNA 상주체의 마이크로리터 1개를 포함한 시약을 결합합니다. 각 플레이트에 야생형 부모 샘플 1개와 DNA 없이 1개의 네거티브 컨트롤을 포함합니다. 증발을 방지하기 위해 각 우물에 미네랄 오일 한 방울을 추가합니다.
그런 다음 접착제 필름으로 플레이트를 밀봉하고 원심분리기를 1, 000배 g에서 1분간 밀봉합니다. 최적화된 어닐링 온도를 사용하여 PCR을 실행합니다. 이제 플레이트에서 접착 필름을 제거하고 플레이트를 HRM 기계에 삽입합니다.
소프트웨어에서 파일 메뉴에서 새 실행을 선택하거나 화면 상단의 실행 버튼을 누릅니다. 55~95도의 용융 온도에 대한 시작 및 종료 온도를 지정합니다. 고해상도 용융 해석을 위해 샘플을 선택하고 음수 제어와 유사한 샘플을 제외합니다.
용융 곡선을 정상화하여 동일한 시작 과 종결 형광을 갖습니다. 시각적으로 낮은 최소 및 낮은 최대 온도 커서가 곡선의 영역에 있는지 확인합니다. 델타 F, 형광의 차이, 05의 기본 설정에서 수준을 유지합니다.
표준 선택 목록에서 공통 및 변형을 선택하고 일반 감도를 선택합니다. H12를 선택하여 야생 유형을 컨트롤로 사용합니다. 델타 F 값이 05보다 큰 샘플은 돌연변이 식물을 포함하는 것으로 간주됩니다.
그런 다음, CTAB 방법을 사용하여, 용융 곡선이 야생 유형과 크게 다른 돌연변이 풀에서 4개의 식물 각각에서 DNA를 추출한다. 분광계를 사용하여 정량화 한 후, 나노 드롭 2000을 사용하여 DNA를 마이크로 리터 당 약 25 나노 그램의 최종 농도로 조정합니다. PCR 튜브의 DNA 샘플에 PCR 프라이머 0.4 마이크로리터를 추가하고 열 사이클러에 배치하고 대상 단편을 증폭시키기 위해 프로그램을 조정합니다.
그런 다음 PCR 제품을 시퀀싱을 위해 회사에 보냅니다. Sanger 시퀀싱 후 M2 식물과 야생 유형 사이의 서열을 비교하여 분자 병변을 비교합니다. 이 연구에서, OSLCT1 또는 SPDT 유전자에 있는 돌연변이를 위한 M2 묘목의 HRM 스캐닝 및 분석은 대부분의 견본이 델타 F 가 05 미만을 가진 야생 모형과 현저하게 다르지 않은 융 곡선이 있었다는 것을 보여주었습니다.
돌연변이는 각각 섭씨 90~92도, 섭씨 81.5도에서 83.5도의 온도에서 델타 Fs가 05보다 큰 HRM 곡선을 보였습니다. 4, 560 M2 묘목에서 유전자에 대한 돌연변이 유형 및 위치는 시퀀싱 크로마토그램에 의해 확인되었다. OsLCT1의 4, 304기원쌍에서 G를 A로 돌연변이하는 이종구스 부위가 확인되었다.
하나의 단일 뉴클레오티드 A 삽입은 OsLCT1의 4, 240기원쌍에 나타났으며, TTC 트리뉴클레오티드 결실은 사민T의 5, 948 에서 5, 950염의 위치에서 관찰되었다. HRM 분석 전에 PCR을 최적화합니다. 젤의 염료는 약간 유해합니다.
젤을 실행할 때 장갑을 착용하는 것을 기억하십시오.
