从果蝇雄性附件腺的二级细胞中分离RNA的FACS协议

这种方法允许对来自果蝇雄性附属腺体的罕见细胞种群进行转录分析，称为继发细胞，并发现基因，使它们成为生殖成功的关键。在一天中，该技术允许从不同基因型中分拣二级细胞，并提取总RNA，以便随后进行qPCR或RNA测序。有时，项目受到起始材料的罕见性限制。

此方法可以为面临处理罕见细胞群的挑战的其他组提供基础。因为这个程序需要积累40个腺体，所以进行解剖很重要。准备自制的移液器提示也很重要，所以你应该把它可视化到视频上，如何制作它，并提前准备。

在开始手术之前，切割和火焰圆，宽，200微升提示处理腺体，并通过多个1000微升尖端打开附近的火焰不到一秒钟，以缩小开口。然后，根据修改的提示，根据它们的渴望速度，从更窄到更宽。对于进入性腺解剖，将20至25名男性果蝇放在冰的玻璃盘中，并使用钳子和解剖显微镜去除一只雄性苍蝇的生殖道。

从所有其他组织（包括睾丸和脱毛球球）中清除附件腺对，并在室温下将附件腺体转移到含有血清补充介质的玻璃板上。收集20对附属腺体后，在室温下将腺体在PBS盘中清洗一至两分钟。在洗涤结束时，将腺体转移到新鲜准备好的分离溶液中，并在解剖显微镜下使用锋利的钳子牢牢捏住腺叶的中间。

使用第二对钳子，用锋利的尖端切割组织，以分离附属腺体的近端区域和伊开精管从含有二次细胞的腺体部分。切割腺体，使乳腺可以到达由外肌层和腺体流明中的粘性保护的细胞。然后，使用预湿、火焰圆、宽、200 微升移液器尖端将腺体转移到 1.5 毫升管中。

对于组织消化，将管子放在37摄氏度的摇床中，每分钟旋转1000次，60分钟。在孵化结束时，停止消化用一毫升血清补充介质，并使用预湿，火焰圆，宽，1000微升移液器尖端转移到24井板样品。在荧光显微镜下检查细胞的GP表达。

大多数腺体尖端应看起来完好无损，一些二级细胞应分离。使用圆圆的、窄的、1000微升的移液器尖端轻轻三到五次三次，以破坏附属腺体组织。然后，使用非常窄的，圆润的，1000微升移液器尖一到两次，以个性化细胞。

让细胞沉淀15分钟。确认细胞在显微镜下看起来健康，并去除多余的介质。然后，将细胞转移到一个新的1.5毫升管中，然后用新鲜的介质冲洗孔，以恢复任何剩余的细胞。

Abd-B-GAL4 构造可用于这些实验，用 GFP 标记辅助细胞，而不是主细胞。在这项研究中，这两种细胞类型都从野生类型和 iab-6cocuD1 突变附属腺体中分类。此 D1 突变体缺乏 Abd-B 和 MSA 转录的表达，影响继发细胞发育、形态和功能。

细胞分离后，FACS用于选择基于 DRAQ7 的活细胞，GFP 荧光水平用于分离二级细胞和主细胞。从每个细胞群体中提取RNA，并调整为每个样本两纳米，用于后续的RT-qPCR和测序。通过野生型主细胞和继发细胞提取物的实时定量PCR对特定基因的表达进行定量，表明仅从二级细胞提取物中检测出二次细胞基因Rab19和MSA，而主细胞基因性肽仅从主细胞样本中检测。

对三种野生类型和三种突变体复制的RNA测序数据的主要成分分析表明，野生类型复制的两个聚类彼此紧密地结合，远离突变样本。与特定基因对齐的可视化读取显示，内务管理基因，如行为素5C，和继发细胞特异性基因Rab19和Dve在两种基因型中均表达。然而，对于MSA，在野生型苍蝇中观察到的基因的强烈表达在突变菌株中丢失。

获得足够的活体分离的继发细胞对于成功的手术很重要。因此，验证了小规模实验中的解剖和分离方案。这种方法允许从少量苍蝇中分拣两种细胞类型的附属腺体，从而研究这些细胞如何对多种遗传或环境条件进行转录反应。

男性生殖成功已知受到许多事物的影响，包括基因型、年龄和交配状态。这种方法的易用性应该使我们能够研究这些因素如何影响附属腺体转录。