שיטה זו מאפשרת ניתוח תעתיק של אוכלוסיית תאים נדירה מבלוטת האביזר הגברית Drosophila, הנקראת התאים המשניים, והיא חושפת גנים המקחיים אותם להצלחת הרבייה. במהלך יום אחד, טכניקה זו מאפשרת מיון של תאים משניים מגנוטיפ שונה ואת החילוץ של RNA הכולל עבור רצף qPCR או RNA הבאים. לפעמים פרויקטים מוגבלים על ידי נדירות של חומר התחלתי.
שיטה זו יכולה לספק את הבסיס לקבוצות אחרות המתמודדות עם אתגר העבודה עם אוכלוסיית תאים נדירה. מכיוון שההליך צריך לצבור 40 בלוטות, חשוב לתרגל את הניתוחים. הכנת טיפים pipette תוצרת בית חשוב גם, ולכן אתה צריך לדמיין את זה על הווידאו איך לעשות את זה ולהתכונן מראש.
לפני תחילת ההליך, לחתוך ולהביים עגול, רחב, 200-microliter טיפים לטיפול בבלוטות, ולהעביר את פתיחת קצה של 1,000-microliter טיפים מרובים ליד להבה במשך פחות משנייה אחת כדי לצמצם את הפתחים. לאחר מכן, מיין את הטיפים שהשתנו מצמצום לרחב יותר בהתבסס על מהירות השאיפה שלהם. עבור ניתוח בלוטת אביזר, מניחים 20 עד 25 זכר Drosophila בצלחת זכוכית על קרח, ולהשתמש מלקחיים מיקרוסקופ ניתוח כדי להסיר את מערכת הרבייה של זבוב זכר אחד.
נקה את זוג בלוטת האביזר מכל הרקמות האחרות, כולל האשכים ונורה שפיכה, ולהעביר את בלוטות האביזר לצלחת זכוכית המכילה מדיום בתוספת סרום בטמפרטורת החדר. כאשר 20 זוגות של בלוטות עזר נאספו, לשטוף את הבלוטות בצלחת של PBS במשך 1 עד 2 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הכביסה, להעביר את הבלוטות לפתרון דיסוציאציה מוכן טרי, ולהשתמש מטליות חדות תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי לצבוט בחוזקה את אמצע האונה הבלוטות.
באמצעות זוג שני של מלקחיים, לחתוך את הרקמה עם הקצה החד כדי להפריד את האזור הפרוקסימלי של בלוטת האביזר ואת צינור השפיכה מחלק הבלוטה המכיל תאים משניים. חותכים את הבלוטות, כך peptidases יכול להגיע לתאים כי הם מוגנים אחרת על ידי שכבת השריר החיצוני ועל ידי נוזל הזרע צמיג בלומן של הבלוטה. לאחר מכן, השתמשו בקצה פיפטה טרום רטוב, מעוגל להבה, רחב, 200 מיקרוליטר כדי להעביר את הבלוטות לצינור 1.5 מיליליטר.
לעיכול רקמות, מניחים את הצינור בשייקר 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ב 1, 000 סיבובים לדקה. בסוף הדגירה, לעצור את העיכול עם מיליליטר אחד של מדיום בתוספת סרום, ולהשתמש מראש רטוב, להבה מעוגל, רחב, 1, 000 מיקרוליטר פיפטה קצה להעביר את הדגימות לצלחת 24 היטב. בדוק את התאים לביטוי GFP שלהם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
רוב קצות הבלוטה צריך להיראות שלם, וכמה תאים משניים צריך להיות מנותק. השתמש מעוגל, צר, 1, 000 מיקרוליטר פיפט קצה כדי triturate בעדינות את התאים שלוש עד חמש פעמים כדי לשבש את רקמת בלוטת האביזר. לאחר מכן, השתמשו בטיפ פיפיאט צר מאוד, מעוגל, 1,000 מיקרוליטר פעם עד פעמיים כדי להפוך את התאים לאינדיבידואליים.
אפשר לתאים להתיישב במשך 15 דקות. ודא כי התאים נראים בריאים מתחת למיקרוסקופ, ולהסיר את המדיום העודף. לאחר מכן, להעביר את התאים לתוך צינור חדש 1.5 מיליליטר, ולשטוף את בארות עם מדיום טרי כדי לשחזר את כל התאים הנותרים.
ניתן להשתמש בבניין Abd-B-GAL4 בניסויים אלה כדי לסמן תאים משניים אך לא ראשיים עם GFP. במחקר זה, שני סוגי התאים היו ממוינים מסוג פראי ובלוטות אביזר מוטציה iab-6cocuD1. מוטציה D1 זה חסר את הביטוי של תעתיקי עבד-B ו- MSA, המשפיעים על התפתחות תאים משניים, מורפולוגיה ותפקוד.
לאחר דיסוציאציה של תאים, FACS משמש לבחירת תאים חיים בהתבסס על DRAQ7, ורמת פלואורסצנטיות GFP משמשת לבידוד תאים משניים ותאים ראשיים. RNA מופק מכל אוכלוסיית תאים ומותאם לשני ננוגרם לדגימה עבור RT-qPCR ותרשים עוקבים. כימות הביטוי של גנים ספציפיים על ידי PCR כמותי בזמן אמת על תמציות תאים ראשיים ומשניים מסוג בר מגלה כי גנים התא המשני Rab19 ו MSA מזוהים רק תמציות תא משני, בעוד פפטיד מין הגן התא הראשי מזוהה רק מדגימות תאים ראשיים.
ניתוח רכיבים עיקריים על נתוני רצף RNA של שלושה סוגים פראיים ושלושה שכפולים מוטנטים מגלה כי סוג הבר משכפל את שני הצבירים הקרובים זה לזה ורחוקים מדגימות המוטנטים. הדמיה של קריאות המיושרות לגנים מסוימים מראה כי גנים של משק בית כגון actin 5C, והגנים המשניים הספציפיים לתאים Rab19 ו- Dve באים לידי ביטוי בשני הגנוטיפים. עבור MSA, לעומת זאת, הביטוי החזק של הגן שנצפה בזבובים מסוג בר הולך לאיבוד בזנים המוטנטים.
השגת מספיק תאים משניים ניתויים חיים חשוב עבור הליך מוצלח. לכן, לאמת את פרוטוקול הניתוח והדיסוציאציה בניסוי בקנה מידה קטן. שיטה זו מאפשרת מיון של שני סוג התאים של בלוטת האביזר ממספר קטן של זבובים, ומאפשרת לחקור כיצד תאים אלה מגיבים בתעתיק לתנאים גנטיים או סביבתיים מרובים.
הצלחה רבייה גברית ידוע להיות מושפע על ידי דברים רבים, כולל גנוטיפ, גיל, מצב הזדווגות. הקלות של שיטה זו אמורה לאפשר לנו לחקור כיצד גורמים אלה משפיעים על שעתוק בלוטת האביזר.
