이 방법은 이차 세포에게 불린 Drosophila 남성 부속선에서 희소한 세포 인구의 전사 분석을 허용하고, 생식 성공을 위해 그(것)들을 중요하게 하는 유전자를 발견합니다. 하루의 과정에서, 이 기술은 후속 qPCR 또는 RNA 염기서열에 대한 상이한 유전자형으로부터 이차 세포의 분류 및 총 RNA의 추출을 허용한다. 때로는 시작 자료의 희귀성에 의해 프로젝트가 제한됩니다.
이 방법은 희귀 한 세포 인구와 함께 작업의 도전에 직면 하는 다른 그룹에 대 한 기초를 제공할 수 있습니다. 절차는 40 땀샘을 축적해야하기 때문에 해부를 연습하는 것이 중요합니다. 수제 파이펫 팁을 준비하는 것도 중요하므로 비디오에 시각화하여 미리 준비하고 준비해야합니다.
시술을 시작하기 전에, 발란, 와이드, 200 마이크로 리터 팁, 그리고 개구부를 좁히기 위해 1 초 이내에 불꽃 근처 여러 1, 000 마이크로 리터 팁의 팁 개구부를 전달합니다. 그런 다음 수정된 팁을 포부 속도에 따라 더 좁아두면 더 넓게 정렬합니다. 접근 선 절제술의 경우 20~25명의 수컷 Drosophila를 얼음에 유리 접시에 넣고 집게와 해부 현미경을 사용하여 한 남성 비행의 생식 기관을 제거하십시오.
고환및 사정전구를 포함한 다른 모든 조직에서 액세서리 선동맥을 지우고, 실온에서 혈청 보충 매체를 함유한 유리 판으로 액세서리 땀샘을 옮긴다. 20쌍의 부속신이 수집되면 실온에서 1~2분 동안 PBS 접시에 땀샘을 씻으실 수 있습니다. 세척이 끝나면 땀샘을 갓 준비된 해리 용액으로 옮기고 해부 현미경으로 날카로운 집게를 사용하여 선 로브의 중간을 단단히 꼬집습니다.
두 번째 쌍의 집게를 사용하여, 날카로운 끝으로 조직을 잘라 액세서리 선과 이차 세포를 포함하는 동맥의 부분에서 사정 덕트의 근접 영역을 분리합니다. 펩티다스가 외부 근육 층과 동맥의 루멘내점 정액에 의해 보호되는 세포에 도달할 수 있도록 땀샘을 잘라냅니다. 그런 다음 미리 습식, 화염 둥근, 넓은 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 땀샘을 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다.
조직 소화의 경우 분당 1, 000 회전에서 60 분 동안 37도 섭씨 셰이커에 튜브를 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 혈청 보충 매체의 1 밀리리터로 소화를 중지하고, 미리 습식, 화염 둥근, 넓은, 1, 000 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 샘플을 24 웰 플레이트로 전송합니다. 형광 현미경의 밑에 그들의 GFP 발현을 위해 세포를 확인하십시오.
선 팁의 대부분은 그대로 보아야하며 몇 가지 보조 세포를 분리해야합니다. 둥근, 좁은, 1, 000 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 부드럽게 액세서리 선 조직을 방해하기 위해 세포를 3 ~ 5 번 세리세팅합니다. 그런 다음 매우 좁은 둥근 1, 000 마이크로 리터 파이펫 팁을 1 ~ 2 번 사용하여 세포를 개별화하십시오.
세포가 15분 동안 정착하도록 허용합니다. 세포가 현미경의 밑에 건강하게 나타나는지 확인하고, 과잉 매체를 제거합니다. 그런 다음 세포를 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고, 남은 세포를 복구하기 위해 신선한 배지로 우물을 헹구십시오.
Abd-B-GAL4 구조는 이러한 실험에서 GFP를 사용하여 이차하지만 주요 세포에 레이블을 지정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는, 두 세포 유형 야생 유형및 iab-6cocuD1 돌연변이 액세서리 땀샘에서 분류되었다. 이 D1 돌연변이는 이차 세포 발달, 형태학 및 기능에 영향을 미치는 Abd-B 및 MSA 전사체의 발현이 부족합니다.
세포 해리 후, FACS는 DRAQ7에 기초하여 살아있는 세포를 선택하는 데 사용되며, GFP 형광 수준은 이차 세포 및 주요 세포를 분리하는 데 사용된다. RNA는 각 세포 집단에서 추출되고 후속 RT-qPCR 및 시퀀싱을 위해 샘플 당 2 나노그램으로 조정됩니다. 야생형 메인 및 이차세포 추출물에 대한 실시간 정량성 PCR에 의한 특정 유전자의 발현을 정량화하면 이차 세포 유전자Rab19 및 MSA가 이차 세포 추출물에서만 검출되는 반면, 주세포 유전자 성 펩타이드는 주 세포 샘플에서만 검출된다.
3개의 야생 모형 및 3개의 돌연변이 복제의 RNA 시퀀싱 데이터에 대한 주요 성분 분석은 야생 모형이 돌연변이 견본에서 멀리 서로 가까이 그리고 멀리 둘 다 클러스터를 복제한다는 것을 보여줍니다. 특정 유전자에 정렬된 시각적 판독은 actin 5C와 같은 가사 유전자와 이차 세포 특이적 유전자Rab19 및 Dve가 모두 유전자형으로 표현된다는 것을 보여줍니다. 그러나 MSA의 경우, 야생형 파리에서 관찰되는 유전자의 강한 발현은 돌연변이 균주에서 손실된다.
충분한 살아있는 해리된 이차 세포를 얻는 것은 성공적인 절차에 중요합니다. 따라서 소규모 실험에서 해부 및 해실 프로토콜을 확인합니다. 이 방법은 소수의 파리로부터 두 세포 유형의 액세서리 선으로 분류할 수 있게 하여, 그 세포가 여러 유전 또는 환경 조건에 전사적으로 반응하는 방법의 연구를 가능하게 합니다.
남성 생식 성공은 유전자형, 나이 및 짝짓기 상태를 포함하여 많은 것들에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있습니다. 이 방법의 용이성은 우리가 이 요인이 액세서리 선 전사에 어떻게 영향을 미치는지 조사할 수 있게 해주어야 합니다.
