受体聚类无处不在，通常对于信级联激活信号是必要的。但是，很少有方法可用于测量聚类的程度。我们使用总内部反射荧光，TIRF显微镜，跟踪FGFR1-mEGFP分子在活细胞的血浆膜中的扩散。
然后，我们应用数字亮度，N&B分析，来描述受刺激受体聚类的动态。TIRF 是细胞表面附近发生的分子事件的快速时间成像的的理想之选，而 N&B 则根据显微镜的照明体积扩散位置确定荧光分子的平均寡聚状态。事实上，这是一个工具，连接在细胞表面的受体的空间时间组织，他们的信令。
N&B 只需要使用具有快速采集模块的显微镜。你可以分析大面积的活细胞，只要掌握荧光波动方法的基本知识。该方法可应用于形成二聚剂或聚类的蛋白质，并可用荧光染料进行计量标记。
如果蛋白质在细胞内隔间中，则使用其他类型的显微镜获取图像。重要的是要准备一个结构，表示荧光团的单体形式，以测量在实验条件下的纯单体亮度作为控制。第一天，在玻璃底菜中，以每毫升10万至20万细胞的浓度，在1.5毫升完整介质中播种的 HeLa 细胞。
种子6至8个复制菜肴，并在37摄氏度的孵化器中孵育。在第二天或第三天，细胞已经达到亚功。将无血清介质与蛋白质质粒添加到一半的盘子中，并在菜的后半部分加入单体和二丁的参考质粒，以转染细胞。
一天后，检查转染细胞是否粘附在盘子底部，细胞膜是否为荧光。丢弃具有过度生长细胞或荧光非常低的盘子。实验前四小时，在37摄氏度下激活显微镜的温度培养箱。
打开显微镜、计算机和照相机，等待摄像机达到零下 75 摄氏度的正确工作温度。在客观镜上放一小滴油。将样品盘放入显微镜的培养箱中，关闭培养箱的门，使培养皿的温度平衡10分钟。
打开荧光灯和 488 纳米激光器。选择荧光对比模式以探索样本，从眼镜镜中搜索细胞以对焦。选择适当的过滤器，通过带通 Ex 490/20 500 和带通 Em 525/50 或类似方式通过显微镜摄像机收集绿色排放。
在荧光模式下从眼部切换到凸轮报告。优化焦点，并更改为 TIRF 模式。然后按照 TIRF 显微镜的说明激活自动校准。
选择合适的照明深度，并优化消光场的方向。切换到第二个摄像机。定义至少 256 x 256 像素的感兴趣区域。
将曝光设置为 1 毫秒，将 EM 增益设置为 1，000。将激光功率调整为 0.5 毫瓦。有必要获得有关蛋白质扩散系数的一些信息，因为暴露时间必须短于荧光分子在发光体积中的平均时间。
在初始条件下运行第一个试验序列，并大致估计信噪比值。在第一时间序列中测量的信号噪声等于 2 到 3 或更高时，这些条件是可以接受的。然后使用将摄像机 2 号连接到显微镜的发射拆分系统的滑块来遮挡图像的一侧。
选择相机文件自动保存选项。以最小信噪比 2 开始采集至少 700 帧的图像系列。在不将盘子从显微镜中拿出来的情况下，添加配体。
选择具有明亮荧光膜的细胞，并快速启动动力学运行的第一个时间序列。搜索第二个单元格，并获取动力学的第二个时间点。为动动运行的每个时间点捕获一个新单元格。
对于每个新盘，重复激光线的对齐和 TIRF 照明的优化。现在转换和保存与相机软件获得的图像文件作为 tif 文件。通过激活 N&B 图形用户相间 MATLAB，在分析软件例程中导入 tif 文件。
丢弃系列，其平均强度配置文件显示超过 10% 光漂白和序列，其中有明显的细胞膜失真或转换过程中采集。明显不聚焦的裁剪框架。仅保留至少 500 个时间帧的分析系列。
首先确定摄像机参数。激活常规校准摄像机。选择探测器噪声区域中至少 20 x 50 像素的区域。
在对数频率与数字电平图中，移动线性红色光标以在曲线的线性部分中分隔高斯。激活 B 键。应用最小装箱 2.2 以减少数据的分散并生成 B-I 直方图。
使用迭代方形光标检查 B-I 直方图。为分析选择一个正方 ROI，并生成所选 ROI 的 B 图。然后保存与所选内容关联的 B 值的 ASCII 文件。
在图形软件中导入 ASCII 以计算数据的频率分布，并获取平均 B 值加或减 S.E.应用 epsilon 方程，以在动动运行的每个时间点派生每个单元的平均亮度。根据规范化方程对数据进行规范化，其中 B't 是配体加法后时间 t 测量的平均 B 值，B'0 是 t 等于零时测量的平均 B 值，即配体加法后 10 到 20 秒。绘制规范化的平均亮度与采集时间，以生成动能运行。
在这项研究中，来自同一培养皿中的两个 HeLa 细胞的代表性结果，这些细胞表示 mEGFP-FGR1 在时间零时捕获，在 FGF2 每毫升添加 20 毫微克后，显示此结果。与参考构造、GPI-mEGFP 和 GPI-mEGFP-mEGFP 二元相比，整个分析序列显示了时间序列的平均强度。所有 B 值的绘图。
B-I直方图。所选 ROI 的 B 图。以及相关的 B 分布直方图。
在以每毫升 FGF2 的 20 毫微克进行刺激后，具有代表性的动力学运行显示平均亮度作为时间函数，描述在细胞表面持续几分钟的缓慢二化过程。当用每毫升NCAM-Fc 50微克刺激时，动力学轮廓显示寡聚混合物中受体的快速和循环过渡，其亮度值也高于二聚体。反复观察到规范化平均值 3。
由于没有分子波动和漂白，必须尽量减少额外的变异。细胞必须很好地粘附在玻璃底盘上，不要过度生长，而不是堆积起来。如果我们对一种蛋白质感兴趣，这种蛋白质在细胞内隔间内扩散得更快，我们可以应用更快的零次，并使用对焦或多光子显微镜的扫描来成像细胞内的图像。
通过我们的方法，当我们想要探索二丁二暗化等事件的动态时，我们将光漂白的不利影响降到最低。这些事件控制着各种细胞反应，很难用其他技术在活细胞中证明。
