수용체 클러스터링은 유비쿼터스이며 종종 캐스케이드 활성화를 신호하는 데 필요합니다. 그러나 클러스터링 정도를 측정하는 방법은 거의 없습니다. 우리는 살아있는 세포의 혈장 막에 있는 FGFR1-mEGFP 분자의 확산을 따르기 위하여 총 내부 반사 형광, TIRF 현미경 검사를 이용합니다.
그런 다음 자극된 수용체 클러스터링의 역학을 설명하기 위해 수 밝기, N&B 분석을 적용합니다. TIRF는 세포 표면 근처에서 발생하는 분자 이벤트의 빠른 시간적 이미징에 이상적이며, N&B는 현미경의 조명 부피 안팎에 확산되는 곳을 기반으로 형광 분자의 평균 올리고머 상태를 결정합니다. 실제로, 이것은 그들이 신호하는 세포 표면에 수용체의 공간 측두조직을 연결하는 도구입니다.
N&B는 빠른 획득 모듈을 갖춘 현미경에 대한 액세스만 필요합니다. 형광 변동 방법에 대한 기본적인 지식을 갖는 살아있는 세포의 넓은 영역을 분석 할 수 있습니다. 이 방법은 희미또는 군집을 형성하는 단백질에 적용될 수 있고 형광염으로 표지될 수 있습니다.
단백질이 세포내 구획에 있는 경우에, 현미경의 그밖 모형은 심상을 취득하기 위해 이용됩니다. 실험 조건하에서 측정하기 위한 형광의 단황 형태를 표현하는 구조를 준비하여 순수한 단황 밝기를 대조군으로 준비하는 것이 중요하다. 첫날, 1.5 밀리리터의 완전한 배지에 있는 종자 HeLa 세포는 유리 바닥 접시에 있는 밀리리터 당 100, 000 에서 200, 000 세포의 농도에서 완전 배지의.
6~8개의 복제 요리를 씨앗으로 만들고, 섭씨 37도에서 인큐베이터로 배양합니다. 둘째 또는 셋째 날에 세포는 종속성에 도달했습니다. 단백질 플라스미드를 첨가하여 접시의 절반에 추가하고, 모노머와 이량으로 레퍼런스 플라스미드를 요리의 후반부에 추가하여 세포를 변형시합니다.
하루 후, 전염된 세포가 접시의 바닥에 부착되어 있고 세포막이 형광인지 확인하십시오. 자란 세포가 있거나 형광이 매우 낮은 요리를 버리십시오. 실험 4시간 전에 현미경의 온도 인큐베이터를 섭씨 37도에서 활성화합니다.
현미경, 컴퓨터 및 카메라를 켜고 카메라가 섭씨 영하 75도의 적절한 작동 온도에 도달할 때까지 기다립니다. 목표 렌즈에 약간의 오일 한 방울을 놓습니다. 샘플 접시를 현미경의 인큐베이터에 넣고 인큐베이터의 문을 닫아 접시의 온도가 10 분 동안 평형화할 수 있도록하십시오.
피성 광등과 488 나노미터 레이저를 켭니다. 피불화 콘트라스트 모드를 선택하여 샘플을 탐색하고 안구 렌즈에서 초점을 맞출 세포를 검색합니다. 밴드패스 Ex 490/20 500 및 밴드패스 Em 525/50 또는 이와 유사한 현미경 카메라를 통해 녹색 방출을 수집하기 위한 적절한 필터를 선택합니다.
피성 형광 모드에서 캠 보고서로 안구에서 전환합니다. 초점을 구체화하고 TIRF 모드로 변경합니다. 그런 다음 TIRF 현미경의 지시에 따라 자동 정렬을 활성화합니다.
적절한 조명 깊이를 선택하고 에반센트 필드의 방향을 최적화합니다. 두 번째 카메라로 전환합니다. 256x256픽셀 이상의 관심 영역을 정의합니다.
노출을 1밀리초로 설정하고 EM 게인을 1, 000으로 설정합니다. 레이저 전력을 0.5 밀리와트로 조정합니다. 노출 시간이 발광 된 부피에서 형광 분자에 의해 소요된 평균 시간보다 짧아야하기 때문에 단백질의 확산 계수에 대한 몇 가지 정보가 필요합니다.
초기 조건에서 첫 번째 평가판 시퀀스를 실행하고 신호 대 잡음 값을 대략 추정합니다. 조건은 첫 번째 계열에서 측정된 바와 같이 2~3개 이상과 동일한 신호-투-노이즈에서 허용됩니다. 그런 다음 카메라 번호 2를 현미경으로 연결하는 배출 분할 시스템의 슬라이더를 사용하여 이미지의 측면을 마스킹합니다.
카메라 파일 자동 저장 옵션을 선택합니다. 최소 신호 대 노이즈 비율이 2개로 최소 700프레임의 이미지 계열 획득을 시작합니다. 현미경에서 접시를 꺼내지 않고, 리간드를 추가합니다.
밝은 형광막을 가진 세포를 선택하고 운동 실행의 첫 번째 시리즈를 빠르게 시작합니다. 두 번째 셀을 검색하고 운동학의 두 번째 시간 지점을 획득합니다. 운동 실행의 각 시간 지점에 대해 새 셀을 캡처합니다.
각 새 접시에 대해 레이저 라인의 정렬과 TIRF 조명의 최적화를 반복합니다. 이제 카메라 소프트웨어로 획득한 이미지 파일을 tif 파일로 변환하고 저장합니다. N&B 그래픽 사용자 MATLAB을 활성화하여 분석 소프트웨어 루틴에서 TIF 파일을 가져옵니다.
평균 강도 프로파일이 10% 이상의 광표백 및 획득 중에 명백한 세포막 왜곡 또는 번역이 있는 시리즈를 표시하는 계열을 폐기하십시오. 분명히 초점이 없는 프레임을 자르는 것입니다. 최소 500개의 기간으로 해석 만 계열에 대해 보관하십시오.
먼저 카메라 매개 변수를 결정합니다. 일상적인 교정 카메라를 활성화합니다. 검출기 노이즈 영역에서 최소 20x 50픽셀의 영역을 선택합니다.
로그 주파수 대 디지털 레벨 플롯에서 선형 빨간색 커서를 이동하여 곡선의 선형 부분에서 가우시안을 구분합니다. B 키를 활성화합니다. 데이터의 분산을 줄이고 B-I 히스토그램을 생성하기 위해 최소 2.2의 비닝을 적용합니다.
반복성 사각형 커서를 사용하여 B-I 히스토그램을 검사합니다. 분석을 위해 사각형 ROI를 선택하고 선택한 ROI의 B 맵을 생성합니다. 그런 다음 선택 영역과 연결된 B 값의 ASCII 파일을 저장합니다.
그래픽 소프트웨어에서 ASCII를 가져와 데이터의 주파수 분포를 계산하고 평균 B-값 플러스 또는 마이너스 S.E.는 운동 실행의 각 시점에서 각 셀의 평균 밝기를 도출하기 위해 epsilon 방정식을 적용합니다. 정규화 방정식에 따라 데이터를 정규화하여, B't는 리간드 첨가 후 시간에 측정된 평균 B값이며 B'0은 리간드 첨가시노 후 10~20초인 0과 같을 때 측정된 평균 B값이다. 정규화된 평균 밝기와 획득 시간을 플롯하여 운동 실행을 빌드합니다.
본 연구에서는, FGF2의 밀리리터당 20나노그램을 첨가한 후, 0및 7시에 포획된 mEGFP-FGR1을 발현하는 동일한 접시에 있는 2개의 HeLa 세포로부터의 대표적인 결과가 여기에 도시된다. 참조 구조, GPI-mEGFP 및 GPI-mEGFP-mEGFP 이머와 비교하여 전체 분석 서열은 타임 시리즈의 평균 강도를 나타낸다. 모든 B 값의 플롯입니다.
B-I 히스토그램. 선택한 ROI의 B 맵. 그리고 관련 B 분포 히스토그램.
FGF2의 밀리리터 당 20 나노그램으로 자극 한 후, 시간의 함수로 평균 밝기를 보여주는 대표적인 운동 실행은 세포 표면에서 몇 분 동안 지속되는 이머티어화의 느린 과정을 설명합니다. NCAM-Fc의 밀리리터 당 50 마이크로그램으로 자극될 때, 운동 프로파일은 올리고머 혼합물에서 수용체의 빠르고 순환적인 전이를 드러내며, 이는 또한 이량제보다 높은 밝기 값에 도달합니다. 정규화된 평균 값 3개가 반복적으로 관찰됩니다.
분자 변동과 표백없이 인해 추가 변이체를 최소화하는 것이 중요합니다. 그리고 세포는 자란 것이 아니라 유리 바닥 접시에 잘 부착되어야하며 쌓이지 않아야합니다. 세포내 구획 내부에 더 빠르게 확산되는 단백질에 관심이 있다면, 0시간을 더 빠르게 적용하고 초점 또는 다광 현미경에서 스캔을 사용하여 세포 내부의 이미지에 사용할 수 있습니다.
우리의 접근 방식을 통해, 우리는 우리가 이질과 같은 이벤트의 역학을 탐구 할 때 표백의 해로운 효과를 최소화. 이러한 이벤트는 다양한 세포 반응을 제어하며 다른 기술로 살아있는 세포에서 증명하기가 매우 어렵습니다.
