Il clustering del recettore è onnipresente e spesso necessario per segnalare un'attivazione a cascata. Tuttavia, sono disponibili pochi metodi per misurare il grado di clustering. Utilizziamo la fluorescenza di riflessione interna totale, microscopia TIRF, per seguire la diffusione delle molecole FGFR1-mEGFP nella membrana plasmatica delle cellule vive.
Quindi applichiamo la luminosità del numero, l'analisi N&B, per descrivere la dinamica del clustering del recettore stimolato. TIRF è ideale per l'imaging temporale veloce di eventi molecolari che si verificano vicino alla superficie cellulare, mentre N&B determina lo stato oligomerico medio delle molecole fluorescenti in base a dove la diffusione in uscita e in uscita il volume di illuminazione del microscopio. In effetti, questo è uno strumento per collegare l'organizzazione temporale spaziale dei recettori sulla superficie cellulare dove stanno segnalando.
N&B ha solo bisogno dell'accesso a un microscopio con un modulo di acquisizione veloce. È possibile analizzare una vasta area di cellule vive con solo la conoscenza di base dei metodi di fluttuazione della fluorescenza. Questo metodo può essere applicato a proteine che formano dimeri o ammassi e può essere etichettato stechiometricamente con il colorante fluorescente.
Se le proteine sono in compartimenti intracellulari, altri tipi di microscopi vengono utilizzati per acquisire le immagini. È importante preparare un costrutto che esprima la forma monomerica del fluoroforo per misurare in condizioni sperimentali la pura luminosità monomerica come controllo. Il primo giorno, seminare cellule HeLa in 1,5 millilitri di mezzo completo ad una concentrazione da 100.000 a 200.000 cellule per millilitro in piatti con fondo di vetro.
Seme da sei a otto replicano i piatti e incubano in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Il secondo o il terzo giorno, le cellule hanno raggiunto la subconfluenza. Aggiungere il mezzo privo di siero con plasmide proteico a metà dei piatti e aggiungere plasmidi di riferimento con il monomero e il dimero alla seconda metà dei piatti per trasfettare le cellule.
Dopo un giorno, controllare che le cellule trasfette siano aderenti al fondo delle stoviglie e che la membrana cellulare sia fluorescente. Scartare i piatti con cellule ricoperte di vegetazione o con fluorescenza molto bassa. Quattro ore prima dell'esperimento, attivare l'incubatore di temperatura del microscopio a 37 gradi Celsius.
Accendi il microscopio, i computer e le telecamere e attendi che le telecamere raggiungano la temperatura di lavoro corretta di meno 75 gradi Celsius. Posizionare una piccola goccia di olio sull'obiettivo. Mettere un piatto campione nell'incubatrice del microscopio e chiudere le porte dell'incubatrice per lasciare che la temperatura del piatto equilibra per 10 minuti.
Accendi la lampada a epifluorescenza e il laser da 488 nanometri. Selezionare la modalità di contrasto dell'epifluorescenza per esplorare il campione, cercando una cella da mettere a fuoco dalla lente oculare. Selezionare il filtro corretto per la raccolta dell'emissione verde attraverso la fotocamera del microscopio con pass a banda Ex 490/20 500 e pass banda Em 525/50 o simili.
Passare dal rapporto oculare alla camma in modalità epifluorescenza. Perfezionare lo stato attivo e passare alla modalità TIRF. Quindi attivare l'allineamento automatico seguendo le istruzioni del microscopio TIRF.
Scegli una profondità di illuminazione adatta e ottimizza la direzione del campo evanescente. Passare a una seconda fotocamera. Definire un'area di interesse di almeno 256 per 256 pixel.
Impostare l'esposizione su un millisecondo e il guadagno em su 1.000. Regolare la potenza del laser a 0,5 milliwatt. È necessario avere alcune informazioni sul coefficiente di diffusione della proteina perché il tempo di esposizione deve essere inferiore al tempo medio trascorso dalle molecole fluorescenti nel volume luminato.
Eseguire una prima sequenza di prova in condizioni iniziali e stimare approssimativamente il valore segnale-rumore. Le condizioni sono accettabili al segnale-rumore pari o superiore a due o tre, come misurato nella prima serie di tempo. Quindi utilizzare il dispositivo di scorrimento del sistema di divisione delle emissioni che collega la fotocamera numero due al microscopio per mascherare un lato dell'immagine.
Selezionare l'opzione di salvataggio automatico del file della fotocamera. Inizia l'acquisizione della serie di immagini per un minimo di 700 fotogrammi con un rapporto segnale-rumore minimo di due. Senza togliere il piatto dal microscopio, aggiungere il ligando.
Selezionare una cella con una membrana a fluorescenza brillante e iniziare rapidamente la prima serie di volte della corsa cinetica. Cerca una seconda cella e acquisisci il secondo punto di tempo della cinetica. Acquisire una nuova cella per ogni punto di tempo dell'esecuzione cinetica.
Per ogni nuovo piatto, ripetere l'allineamento della linea laser e l'ottimizzazione dell'illuminazione TIRF. Ora converti e salva i file di immagine acquisiti con il software della fotocamera come file tif. Importare i file tif nella routine del software di analisi attivando l'interfaccia utente grafica N&B MATLAB.
Serie di scarti per le quali il profilo di intensità media mostra più del 10% di fotobleaching e serie in cui c'è stata un'evidente distorsione o traslazione della membrana cellulare durante l'acquisizione. Ritagliare fotogrammi che sono evidentemente fuori fuoco. Conservare per l'analisi solo serie con almeno 500 tempi.
Determinare innanzitutto i parametri della fotocamera. Attivare la fotocamera calibrata di routine. Selezionare un'area di almeno 20 per 50 pixel nell'area di disturbo del rilevatore.
Nel grafico della frequenza di log rispetto al livello digitale, spostate il cursore rosso lineare per delimitare il gaussiano nella parte lineare della curva. Attivare il tasto B. Applicare un binning minimo di 2,2 per ridurre la dispersione dei dati e generare l'istogramma B-I.
Utilizzare il cursore quadrato iterativo per ispezionare l'istogramma B-I. Selezionare un ROI quadrato per l'analisi e generare la mappa B del ROI selezionato. Salvare quindi il file ASCII dei valori B associati alla selezione.
Importare l'ASCII in un software grafico per calcolare la distribuzione di frequenza dei dati e ottenere il valore B medio più o meno S.E.Applicare l'equazione di epsilon per derivare la luminosità media per ogni cella in ogni punto di tempo della corsa cinetica. Normalizzare i dati in base all'equazione di normalizzazione, dove B't è il valore medio B misurato al tempo t dopo l'addizione del ligando e B'0 è il valore medio B misurato nel momento in cui t è uguale a zero, che è da 10 a 20 secondi dopo l'additino ligando. Tracciate la luminosità media normalizzata rispetto al tempo di acquisizione per costruire la corsa cinetica.
In questo studio, i risultati rappresentativi di due cellule HeLa nello stesso piatto che esprimono mEGFP-FGR1 catturato al tempo zero e sette, dopo l'aggiunta di 20 nanogrammi per millilitro di FGF2, sono mostrati qui. Rispetto ai costrutti di riferimento, GPI-mEGFP e GPI-mEGFP-mEGFP dimero, l'intera sequenza di analisi mostra l'intensità media delle serie temporali. Traccia di tutti i valori B.
Istogramma B-I. Mappa B del ROI scelto. E l'istogramma della distribuzione B associato.
Dopo la stimolazione con 20 nanogrammi per millilitro di FGF2, le esecuzioni cinetiche rappresentative che mostrano la luminosità media in funzione del tempo descrivono il lento processo di dimerizzazione che persiste per diversi minuti sulla superficie cellulare. Quando stimolato con 50 microgrammi per millilitro di NCAM-Fc, il profilo cinetico rivela transizioni veloci e cicliche del recettore in miscele oligomeriche, che raggiunge anche valori di luminosità superiori a quello del dimero. Si osserva ripetutamente un valore medio normalizzato di tre.
È importante ridurre al minimo le varianti extra a causa di nessuna fluttuazione molecolare e sbiancamento. E le cellule devono essere ben aderenti al piatto con fondo di vetro, non ricoperte di vegetazione e non accatastate. Se siamo interessati a una proteina che si diffonde più velocemente all'interno dei compartimenti intracellulari, possiamo applicare zero volte più velocemente e utilizzare la scansione su microscopi focali o multifotoni per l'immagine all'interno della cellula.
Con il nostro approccio, riduciamo al minimo gli effetti dannosi del fotobleaching quando vogliamo esplorare le dinamiche di eventi come la dimerizzazione. Questi eventi controllano una varietà di risposte cellulari e sono molto difficili da dimostrare nelle cellule vive con altre tecniche.
