使用纸屑小鼠研究矿化组织的克隆遗传追踪

通过基因标记单个细胞的荧光蛋白，并跟踪这些细胞随着时间的推移，纸屑鼠标使研究人员揭示了许多生物过程的新见解。我们的协议最大限度地减少了组织采集和成像之间的滞后时间，可应用于任何矿化或非矿化组织，并保存荧光数年。这种方法对于再生医学和发育生物学的所有领域都非常有用，因为它可以应用于不同的细胞群，研究它们的命运和动力学，只要有合适的Cre线可用。

我们的分步说明将展示区分不同荧光蛋白发出的荧光信号差异的最具有挑战性的步骤。首先准备小鼠组织进行成像。对于软组织和矿化头骨和女性从小鼠长达45天，固定在预冷3.7%甲醛PBS的组织，并在4摄氏度孵育6小时，同时轻轻地滚动在旋转器上。

对于 45 天以上的小鼠的矿化组织，如头骨和女性，使用该溶液，准备一升 10%EDTA 溶液，用氢氧化钠将 pH 调整为 8.05，并使用该溶液将甲醛稀释至 3.7%。将组织在4摄氏度下过夜，将甲醛PBS留在3.7%中，以固定组织。第二天，将其放入预冷甲醛EDTA溶液中，在4摄氏度下孵育，同时旋转48小时，确保在孵化过程中更换溶液三次。

然后将组织放入预冷的 30% 蔗糖中，确保将容器填充到边缘，并在 4 摄氏度下轻轻旋转过夜。在早上，使用钳子从蔗糖溶液中去除组织，并在五毫升的最佳切削温度化合物（或 OCT）中冲洗几秒钟。用 OCT 填充预先标记的低温，将组织放在底部，快速工作，以避免样品在室温下坐得太久。

将模具放在干冰上并等待 OCT 凝固，从而嵌入样品。如果不立即使用样品，它们可以储存在零下20摄氏度。从模具中取出块。

在块的顶部和夹头之间应用 OCT，并在低温恒温器中冷却至少五分钟，或直到 OCT 完全凝固。将样品架和铲刀架预冷至零下 20 摄氏度，然后将样品放在夹头支架和刀片架中，让其平衡几分钟。对于产后生长板分析，准备30至160微米的截面。

使用低温恒温器将块和切割组织部分修剪到合适的厚度，并在幻灯片上收集它们。然后在室温下空气干燥幻灯片，直到它们完全干燥，并在零下 20 摄氏度下储存长达 36 个月。准备好使用幻灯片时，将其从冰柜中取出，并将其带到幻灯片支架中的室温。

要拆下 OCT，请用巴氏移液器轻轻将 PBS 涂抹在幻灯片上。对于 160 微米厚的截面，孵育幻灯片 15 分钟，取出液体并涂抹新鲜 PBS 5 分钟以上。在室温下，用 60 毫米长的盖滑将幻灯片安装在 75%硫化乙醇溶液中。

首先，在通道选项卡中单击 RFP 通道，从而使通道的详细信息显示在光路选项卡中。然后单击 T-PMT 旁边的复选框。将幻灯片放在滑动架中，将感兴趣的组织直接放在光路和客观透镜之间。

要本地化组织，请取消选择通道选项卡轨道标题下的 YFP 和 CFP 框。在轨道标题中选择 T-PMT 通道，然后单击采集选项卡中的"实时"，并增加 T-PMT 通道的增益，以便在屏幕上可视化组织选择。使用适当的显微镜旋钮调整幻灯片的位置以定位感兴趣区域和焦点。

然后单击采集选项卡中的"停止"以关闭激光曝光。根据手稿说明定义成像参数，必要时调整针孔尺寸。检查设置以确保记录的信号不重叠，然后在通道选项卡中选择所有三个通道，然后按下捕捉按钮。

单击尺寸选项卡中每个通道上方的蓝色突出显示框，然后手动检查屏幕上的通道之间的重叠，从而在生成的图像中的显示通道之间滚动。如果信号重叠，请重新调整参数，直到它们能够彼此区分。该协议用于标记包骨细胞在表皮软骨和可视化其克隆扩张与年龄。

中心部分通过可视化十字韧带确定，并成像近侧三侧生长板中的克隆。在塔莫西芬给药后，Col2阳性并被贴上五彩纸屑荧光蛋白标签的单个细胞，经过克隆扩张，随后留在生长板中。长期储存后，荧光信号可以可视化。

在准备和成像之前，有些部分被储存了三年多。使用图像分析软件自动进行三维重建，并导出为视频。在冷冻步骤中断开的一部分包含一个重组程度如此高的区域，它可以防止克隆分析，从而演示了此协议遇到的常见问题之一。

根据您的研究问题，使用专门标记您感兴趣的细胞的Cre线可能非常重要。因此，我们建议在重组后不久检查这些细胞中的荧光。使用可致性Cre线至关重要，因为在非可读Cre线中正在进行的DNA重组可以改变溶质细胞的荧光轮廓，从而排除克隆分析。

该协议可以与功能扰动相结合，如基因操纵菌株，药理治疗，手术干预，以及免疫荧光染色的准备部分。