Ao rotular geneticamente células individuais com proteínas fluorescentes e seguir essas células ao longo do tempo, o Rato Confete permitiu que os pesquisadores revelassem novas percepções sobre muitos processos biológicos. Nosso protocolo minimiza o tempo de defasagem entre coleta de tecidos e imagens, pode ser aplicado a qualquer tecido mineralizado ou não mineralizado e preserva a fluorescência por vários anos. Este método é muito útil para todas as áreas de medicina regenerativa e biologia do desenvolvimento, pois pode ser aplicado a diferentes populações celulares para estudar seu destino e sua cinética, desde que uma linha Cre adequada esteja disponível.
Nossas instruções passo a passo demonstrarão o passo mais desafiador para distinguir a diferença de sinais fluorescentes emitidos por diferentes proteínas fluorescentes. Comece preparando o tecido do rato para a imagem. Para tecidos moles e tíbias mineralizadas e femora de camundongos até 45 dias de idade, fixar o tecido em PBS de 3,7% de formaldeído pré-cozido e incuba-lo a 4 graus Celsius por seis horas enquanto rola suavemente em um rotador.
Para tecidos mineralizados como tíbia e femora de camundongos com mais de 45 dias, prepare um litro de solução 10% EDTA com o pH ajustado para 8,05 com hidróxido de sódio e dilua o formaldeído para 3,7% utilizando essa solução. Fixar o tecido mantendo-o em 3,7% de PBS formaldeído durante a noite a 4 graus Celsius. No dia seguinte, coloque-a na solução EDTA formaldeída pré-transformada e incuba-a a 4 graus Celsius enquanto gira por 48 horas, certificando-se de substituir a solução três vezes durante a incubação.
Em seguida, coloque o tecido em 30% de sacarose pré-cozido, certificando-se de encher o recipiente até a borda, e gire-o suavemente durante a noite a quatro graus Celsius. Pela manhã, use fórceps para remover o tecido da solução de sacarose e enxágüe-o em cinco mililitros de composto de temperatura de corte ideal, ou OCT, por alguns segundos. Encha uma criomold pré-rotulada com OCT e posicione o tecido na parte inferior, trabalhando rapidamente para evitar que a amostra fique sentada à temperatura ambiente por muito tempo.
Incorpore a amostra colocando o molde em gelo seco e esperando que o OCT se solidifique. Se as amostras não forem usadas imediatamente, elas podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius. Remova o bloco do molde.
Aplique OCT entre a parte superior do bloco e o mandril e esfrie-o no criostat por pelo menos cinco minutos ou até que o OCT se solidifique completamente. Pré-coe o suporte da amostra e o suporte da lâmina a menos 20 graus Celsius, em seguida, coloque a amostra no suporte do mandril e na lâmina no suporte da lâmina, e deixe-os equilibrar por vários minutos. Para análise da placa de crescimento pós-natal, prepare seções de 30 a 160 micrômetros.
Use o criostat para aparar o bloco e cortar seções de tecido com uma espessura adequada e colecioná-las em lâminas. Em seguida, o ar seque as lâminas à temperatura ambiente até que estejam completamente secas e armazene-as a menos 20 graus Celsius por até 36 meses. Quando estiver pronto para usar o slide, remova-o do congelador e leve-o à temperatura ambiente em um suporte de slides.
Para remover o OCT, aplique suavemente PBS no slide com a pipeta Pasteur. Para seções de 160 micrômetros de espessura, incubar o slide por 15 minutos, remover o líquido e aplicar pbs fresco por mais cinco minutos. Monte os slides em uma solução de 75% de tiodietanol à temperatura ambiente com deslizamentos de cobertura de 60 milímetros.
Primeiro, selecione o canal RFP clicando nele na guia canais, o que faz com que os detalhes do canal sejam exibidos na guia caminho da luz. Em seguida, clique na caixa de marcação ao lado do T-PMT. Coloque o slide no suporte de lâmina e posicione o tecido de interesse diretamente entre o caminho da luz e a lente objetiva.
Para visualizar o tecido, desmarque as caixas YFP e CFP sob a posição de guia de faixas da guia canais. Selecione o canal T-PMT no título de faixas e clique ao vivo na guia de aquisição e aumente o ganho para o canal T-PMT, a fim de visualizar a seleção de tecidos na tela. Ajuste a posição do slide para localizar a região de interesse e concentre-se usando o botão de microscópio apropriado.
Em seguida, clique em parar na guia de aquisição para desativar a exposição ao laser. Defina parâmetros de imagem de acordo com as instruções do manuscrito e ajuste o tamanho do orifício, se necessário. Verifique a configuração para garantir que os sinais gravados não se sobreponham e selecione os três canais na guia canais e pressione o botão snap.
Role entre os canais de exibição na imagem resultante clicando nas caixas azuis destacadas acima de cada canal na guia dimensões e verifique manualmente se sobrepõem entre os canais na tela. Se os sinais se sobreporem, reajuste os parâmetros até que possam ser distinguidos uns dos outros. Este protocolo foi utilizado para rotular condrócitos na cartilagem epífise e visualizar sua expansão clonal com a idade.
A seção central foi determinada visualizando o ligamento cruzado e os clones na placa de crescimento tibial proximal foram imagens. Células individuais que eram Col2 positivas e foram rotuladas com proteínas fluorescentes de Confetti na administração do tamoxifen, sofreram expansão clonal e, posteriormente, permaneceram na placa de crescimento. O sinal fluorescente pode ser visualizado após o armazenamento a longo prazo.
Algumas seções foram armazenadas por mais de três anos antes da preparação e imagem. A reconstrução tridimensional foi conduzida automaticamente com software de análise de imagens e exportada como vídeo. Uma seção quebrada durante a etapa de criosectioning contém uma área com um nível tão alto de recombinação que impediria a análise clonal, demonstrando um dos problemas comuns encontrados com este protocolo.
Dependendo da sua pergunta de pesquisa, usar uma linha Cre que rotula especificamente suas células de interesse pode ser muito importante. Por isso, recomendamos verificar a fluorescência nessas células logo após a recombinação. O uso de linhas cre indutíveis é essencial porque a recombinação contínua do DNA em linhas cre não indutíveis pode alterar o perfil fluorescente das células soluçadas, impedindo assim a análise clonal.
Este protocolo pode ser combinado com perturbações funcionais, como cepas geneticamente manipuladas, tratamentos farmacológicos, intervenções cirúrgicas, bem como a coloração de imuno fluorescência de seções preparadas.
