Konfeti Fare, tek tek hücreleri floresan proteinlerle genetik olarak etiketleyerek ve bu hücreleri zaman içinde takip ederek, araştırmacıların birçok biyolojik süreç hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarmasını sağladı. Protokolümüz doku toplama ve görüntüleme arasındaki gecikme süresini en aza indirir, herhangi bir mineralize veya mineralsiz dokuya uygulanabilir ve floresan'ı birkaç yıl saklar. Bu yöntem rejeneratif tıp ve gelişim biyolojisi tüm alanlar için çok yararlıdır çünkü uygun bir Cre hattı mevcut olduğu sürece kaderlerini ve kinetiklerini incelemek için farklı hücresel popülasyonlara uygulanabilir.
Adım adım talimatlarımız, farklı floresan proteinlerin yaydığı floresan sinyallerin farkını ayırt etmek için en zorlu adımı gösterecektir. Görüntüleme için fare dokusu nu hazırlayarak başlayın. Yumuşak dokular ve mineralize tibiae ve 45 güne kadar farelerden femora için, önceden soğutulmuş 3.7% formaldehit PBS doku düzeltmek ve bir rotator üzerinde yavaşça yuvarlanırken altı saat boyunca 4 derece santigrat de inkübün.
45 gün boyunca farelerden gelen tibiae ve femora gibi mineralize dokular için, sodyum hidroksit ile 8.05'e ayarlanmış pH ile %10 EDTA çözeltisi bir litre hazırlayın ve bu solüsyonu kullanarak formaldehiti %3,7'ye seyreltin. 4 santigrat derece bir gecede% 3.7 formaldehit PBS tutarak doku düzeltin. Ertesi gün, precooled formaldehit EDTA çözeltisi içine yerleştirin ve 48 saat boyunca dönerken 4 santigrat derece kuluçka, kuluçka sırasında üç kez çözüm yerine emin olun.
Sonra önceden soğutulmuş içine doku yerleştirin 30% sakaroz, ağzına kadar konteyner doldurmak için emin olun, ve yavaşça dört derece santigrat gecede döndürün. Sabahları, sakaroz çözeltisinden dokuyu çıkarmak için forseps kullanın ve birkaç saniyeliğine beş mililitre optimum kesme sıcaklığı bileşiği veya OCT içinde durulayın. Önceden etiketlenmiş bir kriyomold'u OCT ile doldurun ve alttaki dokuyu yerleştirin, numunenin oda sıcaklığında çok uzun süre oturmasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.
Kalıbı kuru buzüzerine yerleştirerek ve OCT'nin katılaşmasını bekleyerek numuneyi gömün. Örnekler hemen kullanılmazsa, eksi 20 derecede saklanabilir. Bloğu kalıptan çıkarın.
Bloğun üst ve chuck arasında OCT uygulayın ve en az beş dakika veya OCT tamamen katılaşmaya kadar kriyostat serin. Numune tutucuyu ve bıçak tutucuyu eksi 20 dereceye kadar önceden soğutun, ardından numuneyi ayna tutucuya ve bıçağı bıçak tutucuya yerleştirin ve birkaç dakika boyunca dengede vermelerini bekleyin. Doğum sonrası büyüme plaka analizi için 30 ila 160 mikrometrelik kesitler hazırlayın.
Blok kırpma ve uygun bir kalınlıkta doku kesitleri kesmek ve slaytlar üzerinde toplamak için kriyostat kullanın. Daha sonra tamamen kuruyana kadar oda sıcaklığında kaydırakları kurutun ve eksi 20 derecede 36 aya kadar saklayın. Slaytı kullanmaya hazır olduğunuzda, dondurucudan çıkarın ve slayt tutucuda oda sıcaklığına getirin.
OCT'yi kaldırmak için Pasteur pipetiyle slayta PBS'yi hafifçe uygulayın. 160 mikrometre kalınlığındaki kesitler için, kaydırağı 15 dakika kuluçkaya yatırın, sıvıyı çıkarın ve taze PBS'yi beş dakika daha uygulayın. 60 milimetre uzunluğunda kapak fişleri ile oda sıcaklığında% 75 thiodiethanol bir çözelti içinde slaytlar monte.
İlk olarak, kanal sekmesinde üzerine tıklayarak RFP kanalını seçin ve bu da kanalın ayrıntılarının ışık yolu sekmesinde görüntülenmesine neden olur. Ardından T-PMT'nin yanındaki onay kutusunu tıklatın. Slaytı slayt tutucuya yerleştirin ve ilgi dokusunu doğrudan ışık yolu ile objektif mercek arasına yerleştirin.
Dokuyu yerelleştirmek için, kanallar sekmesinin parça başlığı altında YFP ve CFP kutularını seçin. Parça başlığındaki T-PMT kanalını seçin, ardından satın alma sekmesinde canlı olarak tıklayın ve ekrandaki doku seçimini görselleştirmek için T-PMT kanalının kazancını artırın. Uygun mikroskop tonunu kullanarak ilgi ve odak bölgesini bulmak için slaydın konumunu ayarlayın.
Ardından, lazer pozlamasını kapatmak için satın alma sekmesinde dur'u tıklatın. Görüntüleme parametrelerini el yazması talimatlara göre tanımlayın ve gerekirse iğne deliği boyutunu ayarlayın. Kaydedilen sinyallerin çakışmadığından emin olmak için kurulumu denetleyin, ardından kanallar sekmesindeki üç kanalı da seçin ve tutturma düğmesine basın.
Boyutlar sekmesindeki her kanalın üzerindeki mavi vurgulanmış kutuları tıklatarak, ortaya çıkan görüntüdeki ekran kanalları arasında ilerleyin ve ekrandaki kanallar arasında çakışma olup yok olup yok edin. Sinyaller çakışıyorsa, parametreleri birbirinden ayırt edilene kadar hazırla. Bu protokol, epifiz kıkırdağındaki kondrositleri etiketlemek ve yaşla birlikte klonal genişlemelerini görselleştirmek için kullanılmıştır.
Merkezi bölüm çapraz bağ görselleştirilerek belirlendi ve proksimal tibial büyüme plakasındaki klonlar görüntülendi. Col2 pozitif olan ve tamoksifen uygulaması üzerine Konfeti floresan proteinleri ile etiketlenen tek tek hücreler klonal genişlemeden geçti ve daha sonra büyüme plakasında kaldı. Floresan sinyal uzun süreli depolama dan sonra görüntülenebilir.
Bazı bölümler hazırlık ve görüntülemeden önce üç yılı aşkın bir süre saklandı. Üç boyutlu yeniden yapılanma görüntü analiz yazılımı ile otomatik olarak gerçekleştirildi ve video olarak ihraç edildi. Kriyoding adımı sırasında kırılan bir bölüm, klonal analizi engelleyecek kadar yüksek rekombinasyon seviyesine sahip bir alan içerir ve bu protokolle karşılaşılan yaygın sorunlardan birini gösterir.
Araştırma sorunuza bağlı olarak, özellikle ilgi hücrelerinizi etiketleyen bir Cre satırı kullanmak çok önemli olabilir. Bu nedenle, rekombinasyondan kısa bir süre sonra bu hücrelerde floresan kontrol öneririz. Noninducible Cre hatlarında devam eden DNA rekombinasyon böylece klonal analizi engelleyen soluted hücrelerin floresan profilini değiştirebilirsiniz, çünkü indüklenebilir Cre hatları kullanarak önemlidir.
Bu protokol, genetik olarak manipüle edilmiş suşlar, farmakolojik tedaviler, cerrahi müdahaleler ve hazırlanan bölümlerin immünükopesan floresan boyama gibi fonksiyonel pertürbasyonlarla kombine edilebilir.
