斑马鱼胚胎全山原位杂交和管状测定在iPSC-ECs中研究恩多林在血管发育中的作用

与传统方法相比，全安装、原位杂交、WISH提供了高分辨率和低背景结果。此外，U-滑动板改善焦距，使用较少的愿望可应用于小鼠胚胎，果蝇胚胎和其他组织难以处理。管形成测定可应用于干细胞分化和激素细胞。

愿望使理解突变校正的功能意义变得容易。演示这个程序的人是我实验室的研究助理王勇。在显微镜下工作，使用FemtoJet系统将两个莫福利诺斯的南图和500个MMNA象形图注射到单细胞胚胎中。

多次练习莫菲诺的微注射，直到你能成功地将其注射到细胞中，并保持卵子的完整性。孵育受精卵，直到它们被消减，达到与预期实验相对应的发展状态。如手稿表之一所述。

接下来，使用塑料移液器将20至40个胚胎移植到1.5毫升管中。在室温下加入一毫升新鲜准备的4%PFA溶液。如稿中所述，在固定、清洗和脱水胚胎后，将胚胎放在底部用尼龙网的筛子中。

通过按顺序清洗胚胎，在75%50%和25%甲醇各5分钟中水合物胚胎。用PBST清洗胚胎后，将50微升的蛋白酶K加入胚胎管中。消化后，取出蛋白酶K，用PBST清洗胚胎三次，每次五分钟。

将50至100微升的混合靶探针加入每个管与胚胎。在40摄氏度下孵育胚胎过夜。如手稿所述，清洗胚胎后，使用4%的半甲醛在室温下固定胚胎30分钟。

然后在室温下用2xSSCT溶液清洗胚胎3次，每次15分钟。卸下 SSCT 溶液，用 50 微升安培 1 将其更换。然后在40摄氏度下孵育胚胎。

30分钟后，在室温下用2xSSCT溶液清洗胚胎3次，每次15分钟。卸下 SSCT 解决方案并添加 50 微升安培 2。孵育15分钟后，像之前一样清洗胚胎，加入50微升的安培3，轻轻敲开管子。

在40摄氏度下孵育胚胎。30分钟后，如前面所述，清洗胚胎。然后添加 50 微升的 Amp 4 滴，并小心地敲开管子。

然后在40摄氏度下孵育胚胎15分钟，然后用SSCT洗涤三次。准备胚胎进行成像后，使用 DAB 过氧化物酶基质套件染色标本。在一毫升蒸馏水中，每升50微升的彩色试剂：A、B和C。

并很好地混合以获得完整的DAB工作液。将液体加入试样并盖上十分钟。彻底清洗标本后，使用光学显微镜对标本进行成像。

要开始培养和控制HHT iPSCs，请将地下室膜基质添加到六个孔细胞培养板中，以覆盖井底。在37摄氏度下孵育板一小时。接下来，从井中去除用过的基底膜基质溶液，并在每口井中加入两毫升mTeSR 1介质。

然后将从最后一个通道中收获的 iPSC 板到每井 6 个细胞的大约 1 倍。培养 iPSC 约四天后，用补充的 BEL 培养培养器交换细胞培养培养。生长细胞三天，产生中皮细胞。

要扩大血管内皮细胞，用补充的BEL介质替换该介质四天。然后用相同的培养和培养的细胞再治疗三到四天。使用CD31 Dynabeads根据试剂盒指令净化成熟的血管内皮细胞。

然后通过洗脱缓冲器收集CD31阳性细胞。在含有VEGF165、bFGF和FBS的EC-SFM介质中维护和扩展纯化的内皮细胞。要对内皮细胞进行板式，首先将每井10微升的基底膜基质添加到血管生成板中。

在37摄氏度下孵育板30分钟。通过反复移液，收获内皮细胞，并在内皮生长介质2中重新分配。将50微升的细胞悬浮液加入每个井的凝固基质中，然后在37摄氏度下孵育细胞。

经过三到五个小时的孵育，使用高分辨率显微镜评估内皮管的形成。捕获每个组至少 10 个区域的图像。检查整体管长、管号和分支点。

进行CISH和希望，以确定在受精后24小时胚胎内内蛋白的表达。血源内皮标记和内皮祖细胞标记用于检查内皮沉默的效果。红色箭头指示这些标记（aplnrna 和 npr1a）的表达式显著减少的区域。

内皮管形成测定在内皮蛋白突变体上进行，并控制 iPSC 衍生的内皮细胞。三小时后对管的形成进行评估和拍照。使用 ImageJ 软件对管长度、管号和分支进行量化。

突变内皮细胞形成的分支比控制内皮细胞少。突变内皮细胞的分支在血管内皮生长因子刺激后显著增加。此方法也可用于从外周血生成 iPS。

通过该方法阐明了内分泌在体外和体内血管形成中的作用。知道纠正突变可以改变血管生成，有可能移植回患者的潜在的干细胞治疗。