시투 혼성화의 전체 마운트인 WISH는 기존 방법에 비해 고해상도와 낮은 배경 결과를 제공합니다. 또한, U-슬라이드 플레이트는 마우스 배아, 드로소필라 배아 및 취급이 어려운 다른 조직에 적용될 수 있는 적은 소원을 사용하여 동일한 초점 길이로 초점을 개선한다. 관 형성 분석체는 줄기 세포 분화 안드로겐 세포에 적용될 수 있다.
WISH를 사용하면 돌연변이 교정의 기능적 의미를 쉽게 이해할 수 있습니다. 절차를 시연할 사람은 내 실험실에서 연구 조수인 용왕입니다. 현미경으로 작업, 펨토젯 시스템을 사용하여 1 세포 배아에 Morpholinos의 두 나노 그램과 500 피코그램을 주입.
성공적으로 세포에 주입하고 계란의 무결성을 유지할 수 있을 때까지 Morpholinos의 미세 주입을 여러 번 연습하십시오. zygotes가 비반향될 때까지 자고테를 배양하고 의도된 실험에 해당하는 개발 상태에 도달합니다. 표에 설명된 바와 같이 원고 중 하나.
다음으로 플라스틱 파이펫을 사용하여 20~40개의 배아를 1.5밀리리터 튜브로 옮기습니다. 실온에서 갓 준비된 4% PFA 용액 1밀리리터를 추가합니다. 원고에 설명된 바와 같이 배아를 고정, 세척 및 탈수한 후, 배아를 바닥에 나일론 메쉬로 체에 놓습니다.
배아를 75%50%와 메탄올 25%로 각각 5분간 순차적으로 세척하여 수분을 공급합니다. PBST로 배아를 세척한 후, 배아를 통해 50마이크로리터의 단백질제 K를 튜브에 넣습니다. 소화 후, 단백질을 제거하고 매번 5 분 동안 PBST로 배아를 세 번 씻습니다.
배아를 사용하여 각 튜브에 혼합 표적 프로브의 50~100마이크로리터를 추가합니다. 하룻밤 사이에 배아를 섭씨 40도에서 배양합니다. 원고에 설명된 바와 같이 배아를 세척한 후 4%의 파라포름알데히드를 사용하여 실온에서 30분 동안 배아를 고치게 한다.
그런 다음 실온에서 매번 15분 동안 2x SSCT 용액으로 배아를 세 번 씻는다. SSCT 용액을 제거하고 Amp 1의 50 마이크로리터로 교체하십시오. 그런 다음 섭씨 40도에서 배아를 배양합니다.
30분 후 실온에서 매번 15분 동안 2x SSCT 용액으로 배아를 세 번 씻는다. SSCT 용액을 제거하고 Amp 2의 마이크로리터 50을 추가합니다. 15분 동안 배양하고 배아를 세척한 후 Amp 3의 마이크로리터 50기를 넣고 튜브를 부드럽게 누릅니다.
섭씨 40도에서 배아를 배양하십시오. 30 분 후에 이전에 설명한 바와 같이 배아를 씻는다. 그런 다음 Amp 4의 마이크로리터 50기를 드롭와이즈로 추가하고 조심스럽게 튜브를 누릅니다.
그런 다음 배아를 섭씨 40도에서 15분 동안 배양하고 SSCT로 세 번 씻습니다. 원고에 설명된 바와 같이 이미징을 위한 배아를 준비한 후, DAB peroxidase 기판 키트를 사용하여 표본을 얼룩지게 한다. 각 50마이크로리터의 컬러 시약 A, B, C를 증류수 1밀리리터에 추가합니다.
그리고 완전한 DAB 작업 유체를 얻기 위해 잘 혼합. 시편에 액체를 넣고 10분 동안 덮습니다. 철저하게 표본을 세척 한 후, 그들을 이미지 광학 현미경을 사용합니다.
HHT iPSC의 배양 및 제어를 시작하려면, 우물의 바닥을 커버하기 위해 6 개의 잘 세포 배양 판에 지하 막 매트릭스를 추가합니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 접시를 배양합니다. 다음으로, 중고 지하 멤브레인 매트릭스 용액을 우물에서 제거하고, 각각의 우물에 mTeSR 1 배지의 2밀리리터를 추가한다.
그런 다음 마지막 통로에서 수확한 iPSC를 10배 정도에서 6개의 세포로 플레이트한다. 약 4일 동안 iPSC를 배양한 후, 세포 배양 배지를 보충된 BEL 배지로 교환한다. 중피 세포를 생성하기 위해 3 일 동안 세포를 성장시다.
혈관 내피 세포를 확장하려면 배지를 4 일 동안 보충 된 BEL 배지로 교체하십시오. 그리고 세포를 동일한 배지 및 배양으로 3~4일 간 치료한다. 키트 지침에 따라 CD31 Dynabeads를 사용하여 성숙한 혈관 내피 세포를 정화합니다.
그런 다음 용출 버퍼에 의해 CD31 양수 세포를 수집합니다. VEGF165, bFGF 및 FBS를 함유하는 EC-SFM 배지에서 정제된 내피 세포를 유지 및 확장한다. 내피 세포를 플레이트하기 위해 혈관 신생 판에 잘 당 지하 막 매트릭스 10 마이크로 리터를 첨가하여 시작합니다.
30분 동안 37°C의 플레이트를 배양합니다. 내피 세포를 수확하고 반복적으로 파이펫팅하여 내피 성장 매체 2에서 재보식하십시오. 각 우물의 고형화된 매트릭스에 이 세포 현탁액의 50마이크로리터를 추가한 다음 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
3~5시간 의 배양 후 고해상도 현미경을 사용하여 내피 튜브 형성을 평가합니다. 각 그룹에 대해 최소 10개의 영역의 이미지를 캡처합니다. 전체 튜브 길이, 튜브 번호 및 분기 점을 검사합니다.
CISH와 WISH는 24시간 후 수정 배아에서 엔도글린의 발현을 결정하기 위해 수행되었다. 혈진성 내피 마커와 내피 전구 마커는 endoglin 침묵의 효과를 검사하기 위해 사용되었다. 적색 화살표는 이러한 마커, aplnrna 및 npr1a의 발현이 현저히 감소한 영역을 나타냅니다.
내피관 형성 분석체는 endoglin 돌연변이 및 제어 iPSC 유래 내피 세포에서 수행되었다. 튜브 형성을 평가하고 3 시간 후에 촬영하였다. Tube 길이, 튜브 번호 및 분기는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화되었습니다.
돌연변이 내피 세포는 내피 세포를 제어하는 것보다 적은 가지를 형성했다. 그리고 돌연변이 내피 세포의 가지는 혈관 내피 성장 인자를 가진 자극 후에 현저하게 증가했습니다. 이 방법은 또한 말초 혈액에서 iPS 생성을 위해 사용될 수 있다.
그리고 방법에 의해 체외 및 생체 내 혈관 형성에서 내분비의 역할을 명확히한다. 돌연변이를 교정하면 혈관 신생에 차이를 만들 수 있다는 것을 알고, 잠재적 인 줄기 세포 치료를 위해 환자로 세포를 다시 이식 할 수 있습니다.
