ההר כולו, בהכלאה situ, WISH, מספק רזולוציה גבוהה ותוצאת רקע נמוכה בהשוואה לשיטות מסורתיות. כמו כן, לוחות U-slide לשפר את המיקוד באותו אורך מוקד באמצעות פחות WISH ניתן להחיל על עוברי עכבר, עוברי Drosophila ורקמות אחרות קשה להתמודד. ניתן להחיל את ההתמדה היווצרות הצינור על תאי גזע מובחנים תאי אנדרוגן.
WISH מקלה על הבנת המשמעות התפקודית של תיקון מוטציה. האדם שידגים את ההליך הוא יונג וונג, עוזר מחקר מהמעבדה שלי. עבודה תחת מיקרוסקופ, להשתמש במערכת FemtoJet להזריק שני ננוגרם של Morpholinos ו 500 picograms של MRNA לעוברים של תא אחד.
תרגול microinjection של Morpholinos פעמים רבות עד שאתה יכול להזריק אותו לתאים בהצלחה ולשמור על שלמות הביצים. להדק את הזיגוטים עד שהם dechorionated ולהגיע למצב הפיתוח שמתאים לניסוי המיועד. כמתואר בטבלה אחד של כתב היד.
לאחר מכן, השתמש פיפטה פלסטיק להעביר 20 עד 40 עוברים לצינור 1.5 מיליליטר. הוסיפו מיליליטר אחד של תוסף 4%PFA טרי בטמפרטורת החדר. לאחר תיקון, כביסה ומייבש את העוברים כמתואר בכתב היד, מניחים את העוברים במסמרן עם רשת ניילון בתחתית.
לחות את העוברים על ידי שטיפת רציף אותם ב 75%50% ו 25% מתנול במשך חמש דקות כל אחד. לאחר שטיפת העוברים עם PBST, להוסיף 50 microliters של proteinase K לתוך הצינור עם העוברים. לאחר העיכול, להסיר את proteinase K ולשטוף את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות בכל פעם.
הוסף 50 עד 100 מיקרוליטרים של בדיקות מטרה מעורבות לתוך כל צינור עם העוברים. דגירה העוברים לילה ב 40 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת העוברים כמתואר בכתב היד, השתמשו ב-4% paraformaldehyde כדי לתקן את העוברים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן לשטוף את העוברים בתתבר SSCT 2x שלוש פעמים במשך 15 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. הסר את פתרון SSCT ולהחליף אותו עם 50 microliters של Amp 1. ואז לה הדגירה העוברים ב 40 מעלות צלזיוס.
לאחר 30 דקות, לשטוף את העוברים בתתבר 2x SSCT שלוש פעמים במשך 15 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. הסר את פתרון SSCT והוסף 50 מיקרוליטרים של Amp 2. לאחר הדגירה במשך 15 דקות ושטיפת העובר כפי שנעשה בעבר, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של Amp 3 ומקשים על הצינור בעדינות.
דגירה העוברים ב 40 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות לשטוף את העוברים כמתואר קודם לכן. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של Amp 4 dropwise והקש בזהירות על הצינור.
ואז להדגר את העוברים ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ולשטוף אותם שלוש פעמים עם SSCT. לאחר הכנת העוברים להדמיה כמתואר בכתב היד, השתמש בערכת מצע של DAB peroxidase כדי להכתים את הדגימה. הוסיפו 50 מיקרוליטרים לכל אחד מהריגנסים צבעוניים A, B ו-C למיליליטר אחד של מים מזוקקים.
ומערבבים היטב כדי להשיג נוזל עבודה DAB מלא. מוסיפים את הנוזל לדגימה ומכסים במשך עשר דקות. לאחר שטיפת הדגימות ביסודיות, יש להשתמש במיקרוסקופ אופטי כדי לדמיין אותן.
כדי להתחיל culturing ושליטה של IPSCs HHT, להוסיף מטריצת קרום מרתף לשש צלחות תרבות התא גם כדי לכסות את החלק התחתון של הבארות. דגירה הצלחות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את פתרון מטריצת קרום המרתף המשמש מה בארות, והוסף שני מיליליטר של mTeSR 1 בינוני לתוך כל באר.
ואז צלחת iPSCs שנקטפו מן המעבר האחרון בערך פעם אחת עשרה עד ששת התאים ל הבאר. לאחר culturing iPSCs במשך כארבעה ימים, להחליף את מדיום תרבות התא עם מדיום BEL בתוספת. לגדל את התאים במשך שלושה ימים כדי ליצור תאים mesoderm.
כדי להרחיב את תאי אנדותל כלי הדם, להחליף את המדיום עם מדיום BEL בתוספת במשך ארבעה ימים. ואז לטפל בתאים עם אותו מדיום ותרבות לעוד שלושה עד ארבעה ימים. לטהר את תאי אנדותל כלי הדם הבוגרים באמצעות CD31 Dynabeads על פי הוראות קיט.
לאחר מכן אסוף את התאים החיוביים של CD31 באמצעות מאגר אלוטיון. שמור והרחב את תאי ה אנדותל מטוהרים במדיום EC-SFM המכיל VEGF165, bFGF ו- FBS. כדי צלחת התאים אנדותל, להתחיל על ידי הוספת 10 microliters של מטריצת קרום מרתף לגם לצלחות אנגיוגנזה.
הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לקצור את תאי ה אנדותל ולתלות אותם מחדש בצמיחה אנדותל בינוני 2 על ידי צינורות שוב ושוב. הוסף 50 microliters של מתלי תא זה למטריצה מוצקה בכל באר ולאחר מכן דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר שלוש עד חמש שעות של דגירה, השתמש במיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה כדי להעריך היווצרות צינור אנדותל. לכוד תמונות של עשרה אזורים לפחות עבור כל קבוצה. בדוק את אורך הצינור הכולל, מספר הצינור ונקודות הענף.
CISH ו- WISH בוצעו כדי לקבוע את הביטוי של אנדוגלין בעוברים לאחר ההפריה 24 שעות ביממה. סמן אנדותל המוגני וסמן אב אנדותל שימשו לבחינת ההשפעה של השתק אנדוגלין. החצים האדומים מציינים אזורים שבהם הביטוי של סמנים אלה, aplnrna ו- npr1a, ירד באופן משמעותי.
ההקמה של צינור אנדותל בוצעה על מוטנט אנדוגלין ושליטה בתאי אנדותל שמקורם ב- iPSC. היווצרות הצינור נבדקה וצולמה לאחר שלוש שעות. אורך הצינור, מספר הצינור וההסתעפות כומתו באמצעות תוכנת ImageJ.
תאי אנדותל מוטנטים יצרו פחות ענפים מאשר תאי אנדותל שולטים. וענפים בתאי אנדותל מוטנטים גדלו באופן משמעותי לאחר גירוי עם גורם גדילה אנדותל כלי הדם. שיטה זו יכולה לשמש גם עבור ייצור iPS מדם היקפי.
ועל ידי השיטה מבהיר את התפקיד של אנדוקרינית היווצרות כלי דם במבחנה ו vivo. בידיעה כי תיקון המוטציה יכול לעשות את ההבדל אנגיוגנזה, ניתן להשתיל את התאים בחזרה לחולים לטיפול בתאי גזע פוטנציאליים.
