通过体内显微镜评估的小鼠中白细胞肌渗透

这种实用且可重复的方法可用于可视化导致完整小鼠内白细胞的内皮细胞相互作用。这项技术也为监测体内白细胞招募级联的生理和病理生理过程提供了强有力的工具。该方法可应用于不同的炎症和化粪池模型。

例如，我们最近强调了它的相关性，在研究肌肉病变涉及夸张的肌肉白细胞渗透。我们向考虑使用这项技术的科学家们的建议是，尽可能多地获得实践经验，因为这种方法非常容易受到细微的偏差。演示这个程序的将是西蒙·克拉尼格，一个临床医生和高级科学家从我的实验室。

在确认麻醉实验动物对脚趾捏没有反应后，将鼠标固定在37摄氏度加热垫上的背背卧位上，并使用不可吸收的无菌6-0缝合线在门牙周围吹一个简单的环。将缝合线连接端固定到加热垫上，并使用钳子在中线轻轻抬起皮肤。接下来，在颈部和上胸上做一个直径一到两厘米的圆形切口，并使用钳子仔细解剖周围的肌肉、脂肪和结缔组织。

在气管下放置缝合线。使用小型手术剪刀将大约 1.3 毫米的横向切口切入气管，并在气管的考特端引入聚乙烯管，以确保上气道的安全。用单个圆形结缝合固定管子，并沿着气管右侧定位胡萝卜动脉。

从心肌动脉壁解剖周围组织，并在动脉下传递两块缝合线。将第一根颅状缝合线与肌状动脉的分叉连接，并在不系扎的情况下将第二根缝合线从第一个缝合线定位为约五到八毫米的远方。接下来，将一块30厘米的聚乙烯管连接到一个装满盐水的一毫升注射器针上，并使用7毫米容器夹将胡萝卜动脉紧接到第二缝合线上。

在胡萝卜状动脉中进行约0.5毫米的横向切口，将无菌聚乙烯管引入动脉。用第二个缝合线固定管子并拆下容器夹。然后轻轻按下注射器柱塞，将盐水冲洗到容器中。

为了准备肌酸，将鼠标转移到定制的塑料显微镜框架，阴囊朝向显微镜阶段，用钳子小心地抓住阴囊最端端。轻轻拉阴囊，去除阴囊皮肤直径约五毫米的圆形部分，使开放组织与盐水水合。使用两个钳子解剖松散的结缔组织，并定位两个睾丸。

抓住一个睾丸，轻轻地开始拉出生殖组织，一步一步地取出任何周围的结缔组织。一旦睾丸被外化，将组织的端钉到舞台周围的橡胶圈上，用盐水水合组织。接下来，小心地取出结缔组织，而不损害底层的肌部肌肉。

这是至关重要的，删除所有的结缔组织，这将导致模糊的图像，而不会伤害潜在的肌。当所有组织被切除后，做一毫米横向切口，打开肌，然后从组织远端进行纵向切口。肌肉应该以球形方式打开。

小心地将肌肉铺在玻璃舞台上，将肌肉固定在橡胶圈上，注意不要触摸或伤害组织的中心区域。然后将剩余的睾丸固定到一侧，以允许访问感兴趣的区域，并用 PSS 水合组织。对于肌肉血管的病毒内可视化，将安装的 cremaster 肌肉放在直立显微镜中并选择 40 倍目标。

在 35 至 37 摄氏度的 PSS 连续超融合下执行录制，通过一条小管子，该管子已贴在显微镜的直立目标上，允许将 PSS 与目标一起连续滴到肌肉和组织上。确定毛细后结素。测量直径为 20 到 40 微米的圆环上的微循环。

然后记录来自肌肌的微循环的高分辨率图像在30秒期间不断调整焦点，由于肌肉组织的收缩和松弛的轻微变化。过多的结缔组织会导致模糊的微观图像。在这个具有代表性的微观图像中，直径在20至40微米的毛细管后，可以通过两个较小的容器的汇合来识别。

粘附和滚动的白细胞可以可视化，而循环的白细胞只能在录制视频的慢动作回放中跟踪。多种参数可能会影响体内的白细胞招募，包括心脏输出、血管直径、中心线速度、壁剪速和循环白细胞数量。请注意，中心线速度受心脏输出、周围血管阻力和血管内体积的影响。

例如，通过卡罗提德导管给予的大量罗丹或其他实验物质可提高毛细管后中心线速度，并抑制白细胞捕获和滚动。相反，心脏衰竭、深度麻醉或体温过低可能会减少毛细管后流动。为了确定中心线速度，可以使用自由循环的荧光白细胞，或者白细胞必须用像罗达明这样的荧光试剂染色。

请注意，野生型菌株可能显示生理差异。例如，与C57BL/10ScSn动物相比，C57BL/6小鼠表现出明显增强的白细胞滚动、粘附和迁移。规划和标准化阶段对于掌握该技术非常重要，尤其是在为显微镜准备肌科学肌肉时。

可进行其他可视化白细胞招募的方法，以产生更多信息，并帮助剖析白细胞和内皮细胞对招募级联的个体贡献。该技术为药理冥想剂和新型免疫调节物质的临床前评价提供了一个平台。