Этот практичный и воспроизводимый метод может быть использован для визуализации взаимодействия эндотелийных лейкоцитов, которые приводят к набору лейкоцитов в нетронутой мыши. Этот метод также представляет собой мощный инструмент для мониторинга физиологических и патофизиологических процессов в рамках каскада набора лейкоцитов in vivo. Метод может применяться в различных воспалительных и септических моделях.
Например, недавно мы подчеркнули его актуальность в изучении мускулопатий, связанных с преувеличенной инфильтрацией мышечных лейкоцитов. Наше предложение коллегам-ученым, которые рассматривают возможность использования этого метода, состоит в том, чтобы получить как можно больше практического опыта, насколько это возможно, как метод очень восприимчив к незначительным отклонениям. Демонстрацией процедуры будет Саймон Краниг, врач и старший научный сотрудник из моей лаборатории.
После подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша в анестезированных экспериментальных животных, исправить мышь в спинном лежачем положении на 37 градусов по Цельсию грелки и использовать неабсорбируемых стерильных 6-0 шва, чтобы ветер простой петли вокруг лобных зубов. Лента присоединения концы шва на грелку и использовать пинцет, чтобы мягко поднять кожу в средней линии. Затем сделайте круговой разрез диаметром от одного до двух сантиметров над шеей и верхней грудной клеткой и используйте пинцет, чтобы тщательно вскрыть окружающие мышцы, жир и соединительной ткани.
Поместите шов под трахею. Используйте небольшие хирургические ножницы, чтобы сделать примерно 1,3 миллиметр поперечный разрез в трахею и ввести полиэтиленовую трубку в хвостовой конец трахеи для обеспечения верхних дыхательных путей. Зафиксните трубку, расположенную одним круговым швом узла, и найдите сонную артерию вдоль правой стороны трахеи.
Рассекают окружающие ткани со стенки сонной артерии и проходят два куска шва под артерией. Свяжите первый черепный шов проксимальным к бифуркации сонных артерий и распоистите второй шов около пяти-восьми миллиметров дистального от первого шва без связывания. Затем прикрепите 30-сантиметровый кусок полиэтиленовой трубки к одномиллилитровой шприцевой игле, наполненной солевым раствором, и используйте семимиллиметровый зажим сосуда, чтобы зажать сонной артерии дистоли к второму шву.
Сделать примерно 0,5 миллиметр поперечного разреза в сонной артерии и ввести стерильную полиэтиленовую трубку в артерию. Закрелите трубку вторым швом и удалите зажим сосуда. Затем осторожно угнетайте поршень шприца, чтобы смыть солевой раствор в сосуд.
Чтобы подготовить мышцу креммейстера, перенесите мышь в специально изготовленную рамку пластикового микроскопа с мошонкой, обращенной к стадии микроскопа, и внимательно похватайте мошонку в самом дистальной конце пинцетом. Аккуратно потянув мошонку, удалите круглую секцию мошонки диаметром около пяти миллиметров, сохраняя открытую ткань хорошо увлажненной солевым раствором. Используйте два пинцета, чтобы вскрыть свободную соединительной ткани и найти оба яичка.
Возьмитесь за один яичко и осторожно начать вытаскивая репродуктивной ткани удаления любых окружающих соединительной ткани шаг за шагом. После того, как яички были экстерьеризированы, приколоть дистальный конец ткани к резиновому кольцу, окружающему сцену, и увлажнить ткань солевым раствором. Далее, тщательно удалить соединительной ткани, не нанося вреда основной мышцы креммейстера.
Очень важно удалить все соединительной ткани, что приведет к размытым изображениям без ущерба для основной мышцы креммейстера. Когда все ткани были удалены, сделать один миллиметр поперечный разрез, чтобы открыть мышцу креммейстера, прежде чем сделать продольный разрез от очень дистального до проксимального конца ткани. Мышцы должны открываться сферически.
Тщательно распределите мышцу по стеклянной сцене и прикрепите мышцу к резиновому кольцу, заботясь о том, чтобы не касаться и не навредить центральной области ткани. Затем прикрепите оставшиеся яички в сторону, чтобы дать доступ к области интереса и увлажнить ткани с PSS. Для интравитальной визуализации мышечной сосуда поместите установленную мышцу креммейстера в вертикальный микроскоп и выберите цель 40X.
Выполните записи под непрерывным суперфузией с 35 до 37 градусов по Цельсию PSS через кусок небольшой трубки, которая была записана на пленку к вертикальной цели микроскопа, чтобы непрерывно капать PSS наряду с целью вниз на мышцы и ткани. Определите посткатиллярные венулы. Измерьте микроциркуляцию на венулях диаметром от 20 до 40 микрометров.
Затем рекордно высокое разрешение изображения микроциркуляции из мышцы креммейстера в течение 30-секундного периода непрерывно корректировки фокуса из-за небольших изменений в сокращении и расслаблении мышечной ткани. Избыток соединительной ткани может привести к размытым микроскопическим изображениям. На этом репрезентативном микроскопическом изображении посткаппиллярные венулы диаметром от 20 до 40 микрометров могут быть идентифицированы по слиянию двух более мелких сосудов.
Приверженцы и прокатки лейкоцитов могут быть визуализированы в то время как циркулирующие лейкоциты могут быть отслеированы только в замедленном воспроизведении записанных видео. Множество параметров может повлиять на набор лейкоцитов в виво, включая сердечный выход, диаметр сосуда, скорость центральной линии, скорость настенного стрижки и количество циркулирующих лейкоцитов. Обратите внимание, что на скорость центральной линии влияют сердечный выход, периферическая сосудистое сопротивление и интравазальный объем.
Например, большой объем родамина или другого экспериментального вещества, данного через сонной катетер, увеличивает послекатиллярную центральную скорость и подавляет улавливание и прокатку лейкоцитов. Напротив, сердечная недостаточность, глубокая анестезия или переохлаждение могут уменьшить посткатиллярный поток. Для определения центральной скорости могут быть использованы свободно циркулирующие флуоресцентные лейкоциты или лейкоциты должны быть окрашены флуоресцентными реагентами, такими как родамин.
Обратите внимание, что дикие штаммы типа могут показать физиологическую дисперсию. Например, мыши C57BL/6 демонстрируют явно улучшенный лейкоцит прокатки, адгезии и трансмиграции по сравнению с C57BL/10ScSn животных. Стадии планирования и стандартизации важны для освоения техники, особенно во время подготовки мышц креммейстера к микроскопии.
Другие методы визуализации набора лейкоцитов могут быть проведены для получения дополнительной информации и для вскрытия индивидуального вклада лейкоцитов и эндотелиальных клеток в каскад вербовки. Этот метод обеспечивает платформу для доклинической оценки фармакологических медитаторов и новых иммунных модуляторных веществ.
