Cette méthode pratique et reproductible peut être utilisée pour visualiser les interactions en léucocytes endothélium qui conduisent au recrutement de leucocytes au sein d’une souris intacte. Cette technique présente également un outil puissant pour la surveillance des processus physiologiques et pathophysiologiques dans la cascade de recrutement de leucocytes in vivo. La méthode peut être appliquée dans différents modèles inflammatoires et septiques.
Par exemple, nous avons récemment souligné sa pertinence dans l’étude des musculopathies impliquant l’infiltration musculaire exagérée de leucocyte. Notre suggestion à d’autres scientifiques qui envisagent d’utiliser cette technique est d’obtenir autant d’expérience pratique que possible que la méthode est très sensible à des écarts mineurs. Simon Kranig, clinicien et scientifique principal de mon laboratoire, démontrera l’intervention.
Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez l’animal expérimental anesthésié, fixez la souris dans une position dorsale couchée sur un coussin chauffant de 37 degrés Celsius et utilisez une suture stérile non absorbable 6-0 pour enrouler une boucle simple autour des dents frontales. Collez les extrémités de jointure de la suture à la garniture chauffante et utilisez des pinces à épiler pour soulever doucement la peau à la ligne médiane. Ensuite, faites une incision circulaire d’un à deux centimètres de diamètre sur le cou et le thorax supérieur et utilisez des pinces à épiler pour disséquer soigneusement les tissus musculaires, graisseux et conjonctifs environnants.
Placer une suture sous la trachée. Utilisez de petits ciseaux chirurgicaux pour faire une coupe transversale d’environ 1,3 millimètre dans la trachée et introduire un tube de polyéthylène dans l’extrémité caudale de la trachée pour fixer les voies respiratoires supérieures. Fixez le tube situé avec une seule suture circulaire de noeud et localisez l’artère carotide le long du côté droit de la trachée.
Disséquer le tissu environnant de la paroi de l’artère carotide et passer deux morceaux de suture sous l’artère. Attachez la première suture crânienne proximale à la bifurcation des artères carotides et placez la deuxième suture environ cinq à huit millimètres distal de la première suture sans attacher. Ensuite, fixez un morceau de tube de polyéthylène de 30 centimètres à une aiguille de seringue d’un millilitre remplie de solution saline et utilisez un clip de récipient de sept millimètres pour serrer l’artère carotide distally à la deuxième suture.
Faire une coupe transversale d’environ 0,5 millimètre dans l’artère carotide et introduire le tube stérile de polyéthylène dans l’artère. Fixez le tube avec la deuxième suture et retirez l’agrafe du récipient. Puis déprimez doucement le piston de seringue pour rincer la solution saline dans le récipient.
Pour préparer le muscle cremaster, transférez la souris dans un cadre de microscope en plastique sur mesure avec le scrotum face à l’étape du microscope et saisissez soigneusement le scrotum à son extrémité la plus distale avec des pincettes. En tirant doucement sur le scrotum, retirez une section circulaire d’environ cinq millimètres de diamètre de la peau scrotale en gardant le tissu ouvert bien hydraté avec de la solution saline. Utilisez deux pinces à épiler pour disséquer le tissu conjonctif lâche et localiser les deux testicules.
Saisissez un testicien distally et doucement commencer à retirer le tissu reproducteur en enlevant tous les tissus conjonctifs environnants étape par étape. Une fois que le testicules a été extériorisé, épingler l’extrémité distale du tissu à l’anneau de caoutchouc entourant le stade et hydrater le tissu avec salin. Ensuite, retirez soigneusement le tissu conjonctif sans nuire au muscle cremaster sous-jacent.
Il est essentiel d’enlever tout le tissu conjonctif qui se traduirait par des images floues sans nuire au muscle cremaster sous-jacent. Lorsque tout le tissu a été enlevé, faire une incision transversale d’un millimètre pour ouvrir le muscle cremaster avant de faire une incision longitudinale de l’extrémité très distale à l’extrémité proximale du tissu. Le muscle doit s’ouvrir sphériquement.
Étendre soigneusement le muscle sur le stade de verre et épingler le muscle à l’anneau de caoutchouc en prenant soin de ne pas toucher ou nuire à la région centrale du tissu. Épinglez ensuite les testicules restants sur le côté pour donner accès à la région d’intérêt et hydrater le tissu avec pss. Pour la visualisation intravitale de la vascularisation musculaire, placez le muscle cremaster monté dans le microscope droit et sélectionnez l’objectif 40X.
Effectuez les enregistrements sous superfusion continue avec 35 à 37 degrés Celsius PSS à travers un morceau de petit tube qui a été enregistré à l’objectif droit du microscope pour permettre le goutte d’eau continue de PSS à côté de l’objectif vers le bas sur le muscle et les tissus. Identifier les venules post-capillaires. Mesurer la microcirculation sur des venules d’un diamètre de 20 à 40 micromètres.
Enregistrez ensuite des images haute résolution de la microcirculation du muscle cremaster sur une période de 30 secondes en ajustant continuellement la mise au point en raison de légers changements dans la contraction et la relaxation du tissu musculaire. L’excès de tissu conjonctif peut conduire à des images microscopiques floues. Dans cette image microscopique représentative, les venules post-capillaires qui devraient avoir entre 20 et 40 micromètres de diamètre peuvent être identifiés par la confluence de deux petits vaisseaux.
Les leucocytes adhérents et roulants peuvent être visualisés tandis que les leucocytes circulants ne peuvent être suivis que dans la relecture au ralenti des vidéos enregistrées. Une multitude de paramètres peuvent affecter le recrutement de leucocytes in vivo comprenant la sortie cardiaque, le diamètre du vaisseau, la vitesse de l’axe, le taux de cisaillement de la paroi et le nombre de leucocytes circulants. Notez que la vitesse de la ligne centrale est influencée par la sortie cardiaque, la résistance vasculaire périphérique et le volume intravasal.
Par exemple, un grand volume de rhodamine ou d’autres substances expérimentales administrées par l’intermédiaire du cathéter carotide augmente la vitesse de la ligne centrale post-capillaire et inhibe la capture et le roulement des leucocytes. Au contraire, l’insuffisance cardiaque, l’anesthésie profonde, ou l’hypothermie peuvent diminuer le flux post-capillaire. Pour déterminer la vitesse de la ligne centrale, des leucocytes fluorescents circulant librement peuvent être utilisés ou les leucocytes doivent être tégés avec des réaccents fluorescents comme la rhodamine.
Notez que les souches de type sauvage peuvent montrer une variance physiologique. Par exemple, les souris C57BL/6 démontrent clairement amélioré le roulement, l’adhérence et la transmigration des leucocytes par rapport aux animaux C57BL/10ScSn. Les étapes de planification et de normalisation sont importantes pour maîtriser la technique en particulier lors de la préparation du muscle cremaster pour la microscopie.
D’autres méthodes de visualisation du recrutement des leucocytes peuvent être menées pour fournir des informations supplémentaires et aider à disséquer la contribution individuelle des leucocytes et des cellules endothéliales à la cascade de recrutement. Cette technique fournit une plate-forme pour l’évaluation préclinique des méditants pharmacologiques et des nouvelles substances modulatrices immunitaires.
