인간 배아 줄기 세포는 신경 전구 세포로 분화하고 뉴런 성상세포 및 올리고드엔드로시테로 분화하도록 유도될 수 있다. 그러나, 인간 배아 줄기세포및 신경전구세포로의 분화에 대한 형배양방법은 매우 비효율적이고 생체내 공동배양 시스템에서 개방되어 인간 배아 줄기세포를 이용한 고밀도 단일세포형 배양을 이용하여 용이하게 확장가능한 개선되고 견고한 배양시스템을 제시한다. 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 형 배양은 신경 전구 세포및 후속 분화를 포함한 다양하고 뚜렷한 분화 계보를 따라 다단계 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 연구하는 신속하고 효율적인 시스템을 제공합니다.
인간 배아 줄기 세포를 준비하여 시작 지하 막 매트릭스 코팅 플레이트. 지하 멤브레인 매트릭스 용액을 섭씨 4도에서 적어도 2~3시간 또는 하룻밤 동안 천천히 해동합니다. 해동하면, 차가운 DMEM/F-12에서 매트릭스를 잘 혼합하고, 6웰 플레이트의 각 웰을 희석용액의 1밀리리터로 코팅합니다.
코팅된 플레이트를 실온에서 최소 3시간 또는 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 배양합니다. 지하 막 매트릭스에서 자란 콜로니 타입 H9 인간 배아 줄기 세포의 피더 없는 배양을 통과시키고, 우물에서 배지를 흡인시키고 DPBS의 1밀리리터로 한 번 세척한다. Dispase 용액 1밀리리터를 각 웰에 넣고 20분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
Dispase를 제거하고 DMEM / F-12의 두 밀리리터로 한 번 부드럽게 세포를 씻으십시오. 세척 후, 매체를 제거하고 각 우물에 DMEM / F-12의 두 밀리리터를 추가합니다. 콜로니를 위아래로 부드럽게 분리하여 15 밀리리터 튜브로 옮겨 넣습니다.
2 분 동안 370 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다. 매체를 흡인합니다. 그런 다음 세포 분리 용액 의 2 밀리리터를 추가하고 10 분 동안 섭씨 37도에서 배양하여 세포 펠릿을 단일 세포로 분리합니다.
원심분리를 반복하고 분리 용액을 제거합니다. mTeSR-1 인간 ESC 배지에서 셀을 부드럽게 위아래로 피펫하여 재연합니다. 콜로니 타입의 인간 배아 줄기세포를 단일 세포형 배양에 적응시키기 위해, 10마이크로몰라 ROCK 억제제함유 mTeSR-1의 2밀리리터로 코팅된 지하막 매트릭스 코팅 플레이트의 각 웰에 약 1.5~200만 개의 세포를 플레이트한다.
24시간 후, 락 억제제 없이 배지를 신선한 mTeSR-1로 교체하십시오. 세포가 매일 매체를 변경하는 3 일 동안 단일 세포 유형으로 성장하도록 허용합니다. 4일째에, 분리용액에서 세포를 분리하고 이전에 설명한 대로 다시 플레이트한다.
원고 지시에 따라 세포를 다시 중단하고 배양한 후 작은 배아 몸을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 바닥에 정착시키고 파이펫으로 배지를 부드럽게 제거합니다. EB 매체로 옮기고 7일 동안 낮은 부착 요리로 확장할 수 있도록 합니다. 신경 전구 세포 또는 NPC 분화를 유도하기 위해 단일 세포 유형의 인간 배아 줄기 세포를 분리 용액 1 밀리리터로 분리하고 10 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.
370배 g에서 2분간 세포를 원심분리합니다. 분리 용액 상수분리를 제거합니다. 그런 다음 DMEM/F-12의 세포를 다시 일시 중단합니다.
지하 막 매트릭스에 세포를 플레이트는 10 마이크로 몰라 ROCK 억제제와 mTeSR-1의 2 밀리리터에서 잘 당 두 번 10 의 밀도에서 5 세포의 밀도로 6 웰 플레이트를 코팅. 24시간 후, 배양 배지를 1개의 마이크로몰러 도르소모핀과 5개의 마이크로몰어 SB431542로 보충된 신경 유도 매체로 대체한다. 신경 유도의 처음 4 일 동안 격일로 매체를 변경 한 다음 7 일째에 합류 할 때까지 매일.
7일간의 신경 유도 후, 분리 용액 1밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하여 세포를 분리합니다. 세포를 370배 g로 원심분리하고 분리용액상수체를 제거한다. NPC 확장 매체의 밀리리터 1밀리리터를 넣고 셀을 위아래로 부드럽게 피펫하여 다시 일시 중지합니다.
그런 다음 지하 멤브레인 매트릭스에 NPC 팽창 배지의 2 밀리리터에서 잘 당 10에서 다섯 번째 세포에 1회 플레이트6웰 플레이트를 코팅하였다. 배양이 90%에 도달할 때 필요에 따라 세포를 통과하여 처음 3~4개의 통로 동안 10개의 마이크로몰라 ROCK 억제제를 추가합니다. 확장 기간 동안 격일로 매체를 변경합니다.
PLO 라미닌 코팅 플레이트를 준비하려면 PBS 또는 물에 있는 PLO 스톡 솔루션을 밀리리터당 10 마이크로그램의 최종 농도로 희석한 다음 잘 섞은 다음 6웰 플레이트의 각 웰을 용액 1밀리리터로 코팅합니다. 접시를 섭씨 37도에서 최소 2시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, PBS로 각 우물을 씻고 원고 의 방향에 따라 준비된 라미닌 용액 1 밀리리터로 코트 직후에 잘 씻으실 수 있습니다.
최대 1주일 동안 접시를 섭씨 4도까지 유지하십시오. NPC를 도파미너기뉴런으로 분화하기 위해, 24시간 후 약 50%의 밀도로 NPC 팽창 배지에서 PLO 라미닌 코팅 요리의 세포를 플레이트, 배지를 DA1로 변경하고 그 후 매일 배지를 변경한다. 그들은 합류에 도달 할 때 문화를 통과하기 위해, 분리 용액의 1 밀리리터로 세포를 분리하고 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양.
그런 다음 원심 분리를 370 배 g로 분리하고 분리 용액 상수 분리를 제거합니다. PLO 라미닌 코팅 6웰 플레이트에 있는 배지의 2밀리리터에서 10번 DA1 배지의 1밀리리터에서 세포를 10번 플레이트로 재연한다. NPC를 성상세포로 분화하기 위해 PLO 라미닌 플레이트 및 NPC 팽창 배지의 세포를 50%의 밀도로 플레이트화하여 24시간 후 성상세포 배지로 배지를 변경하고, 이전에 설명한 바와 같이 세포를 전달한다.
콜로니 타입의 인간 배아 줄기세포가 단일 세포형 배양에 적응했을 때, 세포가 고밀도로 유지될 수 있었고, 이어서 수렴에 도달할 때 쉽고 효율적으로 서브배양을 할 수 있었다. 이들 세포는 짧은 G1 상 및 S 상에서 세포의 높은 비율과 같은 식민지 형 인간 배아 줄기 세포의 전형적인 세포 주기 특성을 유지했다. 정량적 PCR 분석은 또한 식민지 형 세포의 것과 비교할 수있는 수준에서 ESC 마커를 표현하는 것을 확인했습니다.
더욱이, 단일 세포 인간 배아 줄기 세포는 3개의 세균 층:엔도름, 중피 및 자궁 절제술에서 세포를 포함하는 배아 체를 형성할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 그 때 는 전형적인 인간 배아 줄기 세포 형태와 NPC 형태의 출현에 의해 표시된 바와 같이 단일 세포 형 인간 배아 줄기 세포가 NPC로 효율적으로 분화되었다는 것을 입증하였다. 분화는 시그니처 NPC 마커의 증가된 발현에 의해 지원되었고 면역염색 및 FACS 분석에 의해 확인되었다.
동일한 분석은 또한 SOX1, PAX6 및 NCAM 단백질에 대해 양성으로 염색된 세포의 90% 이상을 보여주었다. 더욱이, 유래된 NPC는 특징적인 형태화의 출현과 계보 특이적 마커의 발현에 의해 나타난 바와 같이 도파민성 뉴런 및 성상세포로 분화할 수 있었다. 이 절차를 시도할 때, 건강하고 미분화된 인간 배아 줄기 세포 배양을 유지하기 위해 인간 배아 줄기 세포를 고밀도로 판화하는 것이 필수적이다.
이 프로토콜은 기본 연구, 약물 화면 및 신경 퇴행성 의학의 적용을 위해 확장 가능한 전조 및 분화 세포의 간단하고 견고하며 확장 가능한 생산을위한 플랫폼을 제공합니다.
