Эмбриональные стволовые клетки человека могут быть индуцированы, чтобы дифференцироваться в нервные клетки-предшественники, а затем в астроциты нейронов и олигодендроциты. Тем не менее, тип культуры метод для человеческих эмбриональных стволовых клеток и их дифференциации в нейронных клеток-предшественников являются очень неэффективными и открытыми in vivo совместной культуры системы Здесь мы представляем улучшенную и надежную систему культуры, которая легко масштабируется с использованием высокой плотности одноклеточной культуры типа с эмбриональными стволовыми клетками человека. Одноклеточная культура эмбриональных стволовых клеток человека обеспечивает быструю и эффективную систему для изучения молекулярных механизмов, которые регулируют многоступенчатую дифференциацию по различным и различным дифференцированным линиям, включая нейронные клетки-предшественники и их последующую дифференциацию на дополнительные нейронные линии.
Начните с подготовки эмбриональных стволовых клеток человека квалифицированных мембранной мембраны мембраны пластин с покрытием. Медленно оттаивать фундамент мембраны матричного раствора при четырех градусах по Цельсию, по крайней мере два-три часа или на ночь. Когда разморозится, разбавить матрицу в холодной DMEM/F-12 до 2%смешать хорошо, и покрыть каждый хорошо из шести хорошо пластины с одним миллилитр разбавленного раствора.
Инкубировать покрытые пластины при комнатной температуре, по крайней мере три часа или при четырех градусах по Цельсию в одночасье. Для прохождения кормушки свободных культур колонии типа H9 человеческих эмбриональных стволовых клеток, выращенных на мембранной матрице подвала, аспирировать среду из колодцев и мыть один раз с одним миллилитров DPBS. Добавьте один миллилитр раствора Dispase к каждой хорошо и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут.
Удалить Dispase и аккуратно мыть клетки один раз с двумя миллилитров DMEM/F-12. После мытья, удалить средний и добавить два миллилитров DMEM / F-12 к каждому хорошо. Аккуратно отсоедините колонии, трубя вверх и вниз, и перенесите их в 15-миллилитровую трубку.
Центрифуга трубки при 370 раз г в течение двух минут. Аспирировать медиум. Затем разобщить клеточные гранулы в одиночные клетки, добавив два миллилитров раствора клеточного отслоения и инкубации их при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Повторите центрифугу и удалите отслоение раствора. Resuspend клетки в mTeSR-1 человека ESC среды, мягко трубопроводов вверх и вниз. Чтобы адаптировать эмбриональные стволовые клетки типа колонии к культуре одного типа клеток, пластина примерно от 1,5 до двух миллионов клеток в каждый колодец мембранной матрицы подвала покрыты пластины в двух миллилитров mTeSR-1, содержащих 10 микромолярный ингибитор ROCK.
Через 24 часа замените носитель свежим mTeSR-1 без ингибитора ROCK. Позвольте клеткам расти как единый тип клеток в течение трех дней, меняя среду ежедневно. На четвертый день отмежеваться от клеток в растворе отслоения и переописать их, как описано ранее.
После повторного перерасхода и инкубации клеток в соответствии с рукописными указаниями, перенесите небольшие эмбриональные тела в 15 миллилитровую трубку, дайте им осесть на дно и аккуратно удалите среду пипеткой. Перенесите их в EB среды и позволить им расширить в низкой привязанности блюда в течение семи дней. Чтобы вызвать нейро-клетку-предшественник или дифференциацию NPC, отмежеваться от одноклеточного типа эмбриональных стволовых клеток человека с одним миллилитром раствора отслоения и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Центрифуга клетки в течение двух минут при 370 раз г. Удалите отслойное решение супернатантом. Затем повторное приостановление клеток в DMEM/F-12.
Плита клеток на мембранной матрице подвала покрывала шести-хорошо пластины при плотности в два раза от 10 до пятой клетки на колодец в двух миллилитров mTeSR-1 с 10 микромолярный ингибитор ROCK. Через 24 часа замените культурную среду нервной индукционной средой, дополненной одним микромолярным дорсоморфином и пятью микромоларными SB431542. Изменение среды через день в течение первых четырех дней нервной индукции, а затем каждый день, пока слияние не будет достигнуто в день семь.
После семи дней нервной индукции, разобщить клетки, добавив один миллилитр раствора отслоения и инкубации их в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию. Центрифуга клетки в 370 раз г и удалить отслоение раствора supernatant. Добавьте один миллилитр среды расширения NPC и аккуратно пипетки клетки вверх и вниз, чтобы повторно.
Затем пластины один раз от 10 до пятой клетки на колодец в двух миллилитров NPC расширения среды на мембранной матрице подвала покрытием шесть хорошо пластин. Прохождение клеток по мере необходимости, когда культуры достигают 90%-ного слияния, добавляя 10 микромоляных ингибиторов ROCK в течение первых трех-четырех проходов. Изменение среды через день во время расширения.
Чтобы подготовить пластины с покрытием ламинина ООП, разбавить раствор ООП в PBS или воде до конечной концентрации 10 микрограмм на миллилитр, хорошо перемешать, затем покрыть каждый колодец из шести хорошо пластины с одним миллилитром раствора. Инкубировать пластины, по крайней мере два часа при 37 градусов по Цельсию или на ночь при четырех градусах по Цельсию. Далее, мыть каждый хорошо с PBS и сразу после пальто каждый хорошо с одним миллилитров ламинина раствор подготовлен в соответствии с рукописными направлениями.
Держите пластины при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели. Чтобы дифференцировать NPC в дофаминергических нейронов, пластины клеток в ООП ламинин покрытием блюда в среде расширения NPC при плотности около 50%После 24 часов, изменить средний DA1 и изменить средний через день после этого. Чтобы пройти культур, когда они достигают слияния, разъедать клетки с одним миллилитром раствора отряда и инкубировать их в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию.
Затем центрифуга их в 370 раз г и удалить отслоение раствора supernatant. Resuspend клетки в одном миллилитре среды DA1 и плиты один раз от 10 до пятой клетки в двух миллилитров среды на ООП ламинин покрытием шесть хорошо пластин. Чтобы дифференцировать NPC в астроциты, пластины клеток на пластинах ламинина ООП и NPC расширение среды при плотности 50%изменить средний астроцитов среды после 24 часов, и проход клеток, как описано ранее.
Когда эмбриональные стволовые клетки типа колонии были адаптированы к культуре одного типа клеток, было установлено, что клетки могут поддерживаться при высокой плотности, а затем легко и эффективно субкультуры, когда слияние было достигнуто. Эти клетки сохранили характеристики клеточного цикла, характерные для эмбриональных стволовых клеток типа колонии, таких как короткая фаза G1 и высокая доля клеток в фазе S. Количественный анализ ПЦР также подтвердил, что они выражают маркеры ESC на уровнях, сопоставимых с уровнями клеток типа колонии.
Кроме того, было показано, что одноклеточные эмбриональные стволовые клетки человека способны образовывать эмбриональные тела, содержащие клетки из всех трех зародышевых слоев: эндодерма, мезодерма и эктодерма. Затем было продемонстрировано, что одноклеточный тип эмбриональных стволовых клеток человека эффективно дифференцированы в NPC, о чем свидетельствует потеря типичной морфологии эмбриональных стволовых клеток человека и появление морфологии NPC. Дифференциация была поддержана повышенным выражением маркеров NPC подписи и подтверждена иммуностимулятором и анализом FACS.
Тот же анализ также показал, что более 90% клеток окрашены положительным для SOX1, PAX6 и NCAM белков. Кроме того, производные NPC смогли дифференцироваться в дофаминергических нейронов и астроцитов, как указано на появление характерных морфологий и выражение линии конкретных маркеров. При попытке этой процедуры, важно пластины эмбриональных стволовых клеток человека при высокой плотности, с тем чтобы сохранить здоровую, недифференцированную культуру эмбриональных стволовых клеток человека.
Этот протокол обеспечивает платформу для простого, надежного и масштабируемого производства прародителя и дифференцированной клетки, которая будет масштабируемой для базового исследования, лекарственного экрана и применения в нейродегенеративной медицине.
