由于此方法使用患者的外周血确定 PD-1 阻断抗体结合细胞，因此可以确定负责抗肿瘤效应和免疫相关不良事件的特定子集。这种方法只需要少量的血液样本，分析过程相当简单和快速。它只需要一台流动的细胞仪。
首先，将全血样本收集到含有EDTA的血收集管中。在PBS中用1毫升2%胎儿牛血清治疗每5毫升圆底聚苯乙烯流细胞测量管。漩涡10秒。
然后将20微升全血样转移到经过处理的5毫升圆形底部管中。在PBS中加入20个2%FBS微升和10微升人体特异性FC受体阻断试剂。混合好，在室温下孵育15分钟。
接下来，加入500微升红细胞解液缓冲液。混合好，在室温下孵育10分钟。在PBS中加入4毫升2%FBS，在4摄氏度下以400倍g的光转细胞，5分钟。
通过吸气去除上一液。重复洗涤和吸气过程。将细胞在PBS中重新放入100微升2%FBS，并分成两管，每个管50微升。
添加表面标记抗体。混合好，在黑暗中室温下孵育20分钟。与以前一样，在 PBS 中洗涤两次 2%FBS 中的样品。
在PBS中，将细胞重新在200微升中，其中2%FBS。将管子插入流动细胞仪，按照推荐的协议获取细胞。将 10，000 个事件记录为淋巴细胞门，将流数据作为 FCS 文件进行导出以进行分析。
打开分析软件中的文件，单击等型控制文件，以可视化向前散射图与侧散点图和栅极淋巴细胞上的细胞。使用 FSCH 与 FSCW 和 SSCH 与 SSCW 选择单个单元格，并在 CD3 与 CD8 或 CD3 与 CD4 绘图上显示它们。分别门的CD8T细胞和CD4T细胞。
选择封闭单元格，并在 PD-1 与人类 IgG4 绘图上显示它们。然后根据同型控制，选择Q3来识别PD-1阻断抗体结合CD8和CD4T细胞。在这项研究中，浇注策略和流细胞学分析检测到PD-1阻断抗体与T细胞结合，从一滴患者外周血获得。
PD-1与人IgG4图显示了DPD-1阻断抗体在T细胞上的结合状态。橙色点和黑点分别表示抗IgG4抗体和等型控制染色。在PD-1阻断抗体施用之前，不存在人IgG4阳性CD8或CD4T细胞，PD-1表达通过PD-1检测抗体得到确认。
在nivolumab或pembrolizumab药剂后，IgG4可以通过抗IgG4抗体在T细胞上检测，而PD-1检测抗体EH12.1在T细胞上无法识别任何PD-1。红色、蓝色和绿色门分别表示完全绑定、部分绑定和失去绑定。患者停止尼沃鲁马布和彭布罗利祖马布后，PD-1阻断抗体与CD8 T细胞结合的状态下降。
有部分绑定，最后完全失去绑定。请确保将血液样本与 RBC 解血混合。此外，在表面标记染色之前混合 RBC 解解是此方法的关键步骤。
如果研究人员能够接触到先进的流式细胞学机，则可以用越来越多的与此策略相关的标记来评估PD-1阻断抗体结合T细胞，并可用于分析由PD-1阻断抗体引起的不良事件的T细胞表型。对有发展不良事件的患者进行采样对于评估此策略的效用非常重要。
