이 방법은 환자로부터 말초 혈액을 사용하여 PD-1 차단 항체 결합 세포를 결정하기 때문에, 항종양 효과 및 면역 관련 부작용에 대한 특정 하위 집합을 확인할 수 있다. 이 방법은 소량의 혈액 샘플만 필요하며 분석 과정은 매우 간단하고 빠합니다. 그것은 단지 흐름 세포 측정 기계가 필요합니다.
시작하려면 EDTA가 함유 된 혈액 수집 튜브로 전혈 샘플을 수집하십시오. PBS에서 2%의 태아 소 혈청의 1 밀리리터로 각 5 밀리리터 둥근 바닥 폴리스티렌 플로우 세포측정관을 치료하십시오. 10 초 동안 소용돌이.
그런 다음 전혈 샘플 20 마이크로리터를 처리된 5밀리리터 라운드 하단 튜브로 이송합니다. PBS에 2%의 FBS 20마이크로리터와 인간 전용 FC 수용체 차단 시약10마이크로리터를 추가합니다. 잘 섞고 실온에서 15분간 배양하세요.
다음으로, 적혈구 리시스 버퍼의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 잘 섞어서 실온에서 10분간 배양하세요. PBS에 2%FBS의 4밀리리터를 추가하고 섭씨 4도에서 5분 동안 400배 g로 셀을 회전시합니다.
열망으로 상체를 제거합니다. 세척 및 포부 과정을 반복합니다. PBS에서 2%FBS의 100 마이크로리터에서 세포를 다시 중단하고 각각 50 마이크로리터의 2개의 튜브로 분할합니다.
표면 마커 항체를 추가합니다. 잘 섞어서 어둠 속에서 실온에서 20분 간 배양하세요. PBS에서 2%FBS에서 샘플을 2회 세척합니다.
PBS에서 2%FBS의 200 마이크로리터에서 세포를 다시 중단합니다. 튜브를 유동 세포계에 삽입하고 권장 프로토콜에 따라 세포를 습득합니다. 분석을 위해 10, 000 이벤트를 림프구 게이트로 기록하고 흐름 데이터를 FCS 파일로 내보냅니다.
분석 소프트웨어에서 파일을 열고 등색형 제어 파일을 클릭하여 측면 분산 플롯 및 게이트 림프구에 비해 전방 분산에 있는 셀을 시각화합니다. FSCH 대 FSCW 및 SSCH 대 SSCH를 사용하여 단일 셀을 선택하고 CD3 대 CD8 또는 CD3 대 CD4 플롯에 표시합니다. CD8 T 세포 및 CD4 T 셀을 각각 게이트합니다.
게이트된 셀을 선택하고 PD-1대 인간 IgG4 플롯에 표시합니다. 그리고 동종형 제어를 기반으로, PD-1 차단 항체 바인딩 CD8 및 CD4 T 세포를 식별하기 위해 Q3을 선택합니다. 이 연구에서는, 게이팅 전략 및 유동 세포측정 분석은 환자 말초 혈액의 한 방울로부터 얻은 T 세포에 대한 PD-1 차단 항체 결합을 검출하였다.
인간 IgG4 플롯대 PD-1 플롯은 T 세포에 PD-1 차단 항체의 결합 상태를 나타낸다. 주황색 점과 검은 점은 각각 안티 IgG4 항체 및 동형 대조군 염색을 나타낸다. PD-1 차단 항체가 투여되기 전에, 인간 IgG4 양성 CD8 또는 CD4 T 세포가 존재하지 않았으며 PD-1 발현은 항체를 검출하는 PD-1에 의해 확인되었다.
니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 투여 후, IgG4는 항-IgG4 항체에 의해 T 세포에서 검출될 수 있는 반면, PD-1 검출 항체 EH12.1은 T 세포에 대한 어떤 PD-1도 인식하지 못한다. 빨간색, 파란색 및 녹색 게이트는 각각 완전한 바인딩, 부분 바인딩 및 바인딩 손실을 나타냅니다. 환자가 니볼루맙과 펨브롤리주맙을 중단한 후, CD8 T 세포에 결합하는 PD-1 차단 항체의 상태가 감소하였다.
부분 바인딩이 있었고 마침내 바인딩이 완전히 손실되었습니다. 혈액 샘플을 RBC 리시스와 혼합하십시오. 또한 표면 마커 염색 전에 RBC 리시스를 혼합하는 것이 이 방법의 핵심 단계이다.
연구원이 고급 유동 세포측정기에 접근할 수 있는 경우, PD-1 차단 항체-바운드 T-세포는 이 전략과 관련된 점점 더 많은 마커로 평가될 수 있으며 PD-1 차단 항체에 의한 부작용을 담당하는 T세포 표현형을 프로파일링할 수 있다. 개발 된 부작용을 가진 환자에서 샘플링이 전략의 유용성을 평가하는 것이 중요합니다.
