Поскольку этот метод определяет PD-1-блокирующие клетки, связанные с антителами, используя периферическую кровь у пациентов, можно определить конкретное подмножество, отвечающее за противоопухолевые эффекты и связанные с иммунитетом неблагоприятные явления. Этот метод требует лишь небольшое количество образца крови и процесс анализа довольно прост и быстр. Ему просто нужна машина цитометрии потока.
Для начала соберите целые образцы крови в трубки для сбора крови, содержащие ЭДТА. Лечить каждые пять миллилитров круглого дна полистирола потока цитометрии трубки с одним миллилитром 2%фетальной сыворотки крупного рогатого скота в PBS. Вихрь в течение 10 секунд.
Затем перенесите 20 микролитров целых образцов крови в обработанные пятими миллилитровые круглые нижние трубки. Добавьте 20 микролитров 2%FBS в PBS и 10 микролитров рецептора FC, блокирующего реагент. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
Далее добавьте 500 микролитров буфера лиза красных кровяных телец. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Добавить четыре миллилитров 2%FBS в PBS и спина вниз клетки на 400 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.
Удалите супернатант стремлением. Повторите процесс мытья и аспирации. Повторное использование клеток в 100 микролитров 2%FBS в PBS и разделить на две трубки по 50 микролитров каждый.
Добавьте поверхностные маркерные антитела. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте. Мыть образцы в два раза в 2%FBS в PBS, как и раньше.
Повторное распределение клеток в 200 микролитров 2%FBS в PBS. Вставьте трубки в цитометр потока и приобретйте клетки в соответствии с рекомендуемым протоколом. Запись 10 000 событий, как лимфоцитов ворота и данные экспортного потока, как FCS файлов для анализа.
Откройте файлы в программном обеспечении анализа и нажмите на файл управления изотипом, чтобы визуализировать клетки на вперед рассеяния по сравнению с боковой участок рассеяния и ворота лимфоцитов. Выберите одиночные ячейки с использованием FSCH против FSCW и SSCH против SSCW и отобразить их на CD3 против CD8 или CD3 против участка CD4. Ворота CD8 Т-клеток и CD4 Т-клеток соответственно.
Выберите закрытые ячейки и отобразить их на PD-1 против человека IgG4 участка. А затем, основываясь на контроле изотипа, выберите No3 для определения PD-1-блокирующих антител связанных CD8 и CD4 Т-клеток. В этом исследовании стратегия гэтинга и анализ цитометрии потока обнаружили PD-1-блокирующие антитела, связывающиеся с Т-клетками, полученными из капли периферической крови пациента.
Сюжет PD-1 против человека IgG4 показывает связывающий статус PD-1-блокирующих антител на Т-клетках. Оранжевые точки и черные точки указывают на антитела против IgG4 и окрашивание изотипа соответственно. До PD-1-блокирующих антител вводили, ни один человек IgG4 положительные CD8 или CD4 Т-клеток присутствовали и PD-1 выражение было подтверждено PD-1 обнаружения антитела.
После nivolumab или pembrolizumab администрации, IgG4 может быть обнаружен на Т-клеток анти-IgG4 антитела в то время как PD-1 обнаружения антитела EH12.1 не признает каких-либо PD-1 на Т-клеток. Красные, синие и зеленые ворота указывают на полную привязку, частичную привязку и потерю связывания соответственно. После того, как пациенты прекратили nivolumab и pembrolizumab, статус PD-1-блокирующих антител связывания с CD8 Т-клеток снизилась.
Произошла частичная привязка и, наконец, полная утрата привязки. Пожалуйста, не забудьте смешать образец крови с РБК лиза, а также. Кроме того, смешивание РБК лиза до окрашивания поверхностного маркера является ключевым шагом в этом методе.
Если исследователь имеет доступ к передовой цитометрии потока машины, PD-1-блокирующих антител связанных Т-клеток могут быть оценены все больше и больше маркеров, связанных с этой стратегией могут быть применены для профилирования Т-клеток фенотипов, ответственных за неблагоприятные события, вызванные PD-1-блокирующих антител. Выборка у пациентов с развитыми неблагоприятными явлениями важна для оценки полезности этой стратегии.
