使用毛细血管电泳免疫测定来寻找人类血小板肌萎缩性侧索硬化的潜在生物标志物

该协议可用于优化单个检测板中的蛋白质和原抗体浓度，并使用单个样品制备进行两次测定。该技术的主要优点是，它允许在3个半小时内完成2天1/2天的实验室工作，包括数据分析。该技术为ALS开发基于血液的生物标志物提供了高通量检测格式，是进行大型临床试验的理想方法。

该方法可以深入了解疾病预后期间的目标蛋白质特征，并有助于监测有趣的临床试验药物的效果。从ALS患者和健康受试者那里收集100微升人体血小板酸盐后，填写内部生成的毛细管布局和样品制备模板。样品混合物制备表是动态的，将自动计算应从源中去除多少体积。

将所有检测试剂放在冰上。标准包除外，标准包装应保持在室温下。要准备荧光母体混合物，在DTT的透明管中加入40微升的去维化水，并加入20微升10倍样品缓冲液。

和20微升的准备了400毫摩尔DTT溶液的粉红色管从检测套件。要准备生物素化梯子，在试剂盒中提供的白色管中加入 16 微升的去维化水、两个 10 倍样品缓冲液的微升和制备的 400 毫摩尔 DTT 溶液的两个微升。轻轻混合后，在变性前将梯子溶液转移到 200 微升 PCR 管中。

将1.5微升10X样品缓冲液和148.5微升的去维化水加入600微升微离心管和涡流混合，然后再将管放在冰上。如表中所示，直接添加感兴趣的抗体稀释剂，并在同质抗体溶液中多次冲洗移液器尖端。要准备毛细管样品混合物，请打开所有PCR管，并使用反向移液技术将荧光5X样品缓冲液的1.6微升等分添加到每个管中。

添加缓冲液时立即关闭每个管。添加所有缓冲区后，打开所有管，并添加 0.1X 样本缓冲器，如表中所示，在添加缓冲区时立即关闭每个管。接下来，打开所有管子，并加入蛋白质样本，如表中所示，并立即关闭每个管盖。

添加所有样品后，将所有管材短暂离心机在台式离心机中离心。漩涡再次混合和离心样品。在第二次离心结束时，将所有管子放入带加热盖的热循环器中。

并在指示条件下使样本变性。在变性结束时，离心机，再次混合和离心样品，并放置所有管架在冰上。使用该图作为指南，在井 D1 中添加 10 微升的链球菌马萝卜过氧化物酶， 10微升的合适二级抗体井D2至D5，10微升抗体稀释剂到每口井B和井C1，10微升的适当初级抗体井C2至C25，5微升生物基化梯从PCR管1号到井A1，三微升样品到行 A2 通过 A25 和 15 微升新鲜制备的过氧化物过氧化物到 E 行的每一口井。

然后在每个指定的洗涤缓冲液井中加入500微升的洗涤缓冲液。通过离心旋转板内板内容物。要对检测板执行毛细管分析，请将毛细管分析仪连接到联机系统，然后单击分析仪软件中的"仪器和连接"。

在弹出菜单中选择仪器序列号，然后单击"连接"。选择"检测"选项卡，然后选择"新检测"，输入检测参数并保存文件名和位置。然后确认分析仪中闪烁的蓝色指示灯为纯蓝色，并从包装中取出毛细管盒。

从检测板上取下保护密封件，目视观察预填充孔的气泡。将检测板放在板架中，以一定角度握住毛细管盒，将墨盒插入毛细管槽并关闭分析器门。然后单击分析器软件中的"开始"。

在测定中使用整个血小板利盐混合物可能会降低目标蛋白质的信号强度，并有助于高背景信号。因此，在此测定中，在破坏血小板后使用了透明上清液。血小板细胞索蛋白浓度的线性动态范围建立在每毫升0.2至0.8毫克之间，采用论文模板，使蛋白质浓度和原抗体滴定均能在一次测定中进行。

由于毛细管测定的灵敏度更高，高动态范围检测配置文件可提供显著更宽的动态范围，从而在更大的样品浓度范围内实现更好的检测和定量。还可以定义单个曝光时间。利用优化的测定条件，利用两组抗体对从ALS患者获得的血小板利盐细胞酸分进行分析，可识别样品中疾病特异性TDP-43及其磷酸酯。

然后，使用校准曲线对总 TDP-43 进行量化。在汇集的人类ALS血小板细胞细胞酸分中测试了内部和间运行间测定变异性。此方法允许使用原抗体，有助于在单个测定运行中识别同一样品中多达五个不同的靶蛋白。

该技术不仅大大缩短蛋白质分析时间，还需要微升样品量，并产生具有高度可重复性的结果。这种测定中使用的一些化学物质和所有人体样品都被认为是生物危害，因此在进行这些实验时应始终使用适当的个人防护设备。