Dieses Protokoll kann verwendet werden, um sowohl Protein- als auch Primärantikörperkonzentrationen in einer einzigen Assayplatte zu optimieren und zwei Assays mit einer einzigen Probenvorbereitung durchzuführen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, 2 1/2 Tage Laborarbeit einschließlich Datenanalyse in 3 1/2 Stunden abzuschließen. Diese Technik bietet ein Assay-Format mit hohem Durchsatz für die Entwicklung eines blutbasierten Biomarkers für ALS und ist eine ideale Methode für die Durchführung großer klinischer Studien.
Diese Methode kann Einblicke in Zielproteinprofile während der Krankheitsprognose geben und die Überwachung der Auswirkungen von Medikamenten interessanter klinischer Studien erleichtern. Nach dem Sammeln von 100 Mikrolitermenschlicher Thrombozytenlysate von ALS-Patienten und gesunden Probanden füllen Sie eigenerzeugte Schablonen für das Kapillarlayout und die Probenvorbereitung aus. Die Probenmischungsvorbereitungstabelle ist dynamisch und berechnet automatisch, wie viel Volumen aus der Quelle entfernt werden soll.
Alle Assay-Reagenzien auf Eis legen. Mit Ausnahme der Standardpackung, die bei Raumtemperatur bleiben sollte. Um den fluoreszierenden Master-Mix vorzubereiten, fügen Sie 40 Mikroliter entionisiertes Wasser in ein klares Röhrchen DTT ein und fügen Sie 20 Mikroliter 10-fachen Probenpuffer hinzu.
Und 20 Mikroliter der vorbereiteten 400 Millimolar DTT-Lösung für das rosa Rohr aus dem Assay-Kit. Zur Vorbereitung der biotinylierten Leiter fügen Sie 16 Mikroliter entionisiertes Wasser, zwei Mikroliter 10X Probenpuffer und zwei Mikroliter der vorbereiteten 400 Millimolar DTT-Lösung in das weiße Rohr im Kit. Nach dem schonenden Mischen die Leiterlösung vor der Denaturierung in ein 200-Mikroliter-PCR-Rohr übertragen.
Fügen Sie 1,5 Mikroliter 10X Probenpuffer und 148,5 Mikroliter entionisiertes Wasser in ein 600 Mikroliter Mikrozentrifugenrohr und Wirbel ein, bevor Sie die Röhre auf Eis legen. Fügen Sie die in der Tabelle angegebenen Antikörper direkt das Verdünnungsmittel hinzu und spülen Sie die Pipettenspitze mehrmals in einer homogenen Antikörperlösung. Um den Kapillarprobenmix vorzubereiten, öffnen Sie alle PCR-Röhren und fügen Sie 1,6 Mikroliter Aliquots fluoreszierenden 5X Probenpuffer zu jeder Röhre hinzu, wie in der Tabelle mit einer Reverse Pipettiertechnik angegeben.
Schließen Sie jedes Rohr sofort, wenn der Puffer hinzugefügt wird. Wenn der gesamte Puffer hinzugefügt wurde, öffnen Sie alle Rohre, und fügen Sie einen 0,1X-Probenpuffer in Volumes hinzu, wie in der Tabelle angegeben, und schließen Sie jedes Rohr sofort, wenn der Puffer hinzugefügt wird. Als nächstes öffnen Sie alle Tuben und fügen Sie die Proteinproben, wie in der Tabelle angegeben, und schließen Sie sofort jede Rohrkappe.
Wenn alle Proben zugegeben sind, zentrieren Sie kurz alle Rohre in einer Tischzentrifuge. Wirbel, um die Proben wieder zu mischen und zu zentrifugieren. Am Ende der zweiten Zentrifugation alle Rohre in einen Thermocycler mit einem beheizten Deckel legen.
Und denaturiert die Proben unter den angegebenen Bedingungen. Am Ende der Denaturierung zentrifugieren, mischen und zentrifugieren Sie die Proben wieder und legen Sie alle Rohre in einem Rohrgestell auf Eis. Mit der Figur als Leitfaden, fügen Sie 10 Mikroliter Streptavidin Meerrettich peroxidase gut D1, 10 Mikroliter des geeigneten Sekundärantikörpers an den Brunnen D2 bis D5, 10 Mikroliter Antikörperverdünnung zu jedem Brunnen in Reihe B und zu gut C1, 10 Mikroliter des geeigneten Primärantikörpers an die Brunnen C2 bis C25, fünf Mikroliter biotinylierte Leiter von PCR-Röhrchen Nummer eins bis gut A1 , drei Mikroliter Probe zu den Reihen A2 bis A25 und 15 Mikroliter frisch zubereitetes Luminolperoxid an jeden Brunnen der Reihe E.Pipetting der Probenmischung und das Reagenz in den winzigen Brunnen in den richtigen Reihenfolgeisten ist entscheidend für den Erfolg des Experiments, daher sollte es sehr sorgfältig durchgeführt werden.
Dann fügen Sie 500 Mikroliter Waschpuffer zu jedem ausgewiesenen Waschpuffer gut. Und drehen Sie den Platteninhalt durch Zentrifugation. Um die Kapillaranalyse auf der Assayplatte durchzuführen, schließen Sie den Kapillaranalysator an das Online-System an und klicken Sie in der Analyzer-Software auf Instrument und Connect.
Wählen Sie die Seriennummer des Instruments im Popup-Menü aus, und klicken Sie auf Verbinden. Wählen Sie die Registerkarte Assay aus, und wählen Sie Neuer Assay aus, geben Sie die Assay-Parameter ein und speichern Sie den Dateinamen und den Speicherort. Bestätigen Sie dann, dass der blinkende blaue Indikator im Analysator ein durchgehendes Blau ist, und entfernen Sie die Kapillarpatrone aus ihrer Verpackung.
Entfernen Sie die Schutzdichtung von der Assayplatte und beobachten Sie die vorgefüllten Brunnen visuell auf Luftblasen. Legen Sie die Assayplatte in den Plattenhalter und halten Sie die Kapillarpatrone in einem Winkel, setzen Sie die Patrone in den Kapillarschlitz ein und schließen Sie die Analysatortür. Klicken Sie dann in der Analyzer-Software auf Start.
Die Verwendung eines ganzen Thrombozytenlysatgemisches im Assay kann die Signalintensität der Zielproteine reduzieren und zu einem hohen Hintergrundsignal beitragen. Daher wurde bei diesem Test nach dem Bruch der Blutplättchen ein klarer Überstand verwendet. Ein linearer Dynamikbereich für die Thrombozytosolproteinkonzentration wurde mit 0,2 bis 0,8 Milligramm pro Milliliter festgelegt, und es wurde eine Essay-Vorlage angenommen, so dass sowohl die Proteinkonzentration als auch die primäre Antikörpertitration in einem einzigen Test durchgeführt werden konnten.
Das Erkennungsprofil mit hohem Dynamikbereich bietet aufgrund der höheren Empfindlichkeit des Kapillar-Assays einen deutlich größeren Dynamikbereich, was zu einer besseren Detektion und Quantifizierung über einen größeren Probenkonzentrationsbereich führt. Auch individuelle Belichtungszeiten können definiert werden. Unter Verwendung der optimierten Assay-Bedingungen ermöglicht diese Analyse von Zytosolfraktionen des Thrombozytenlysats, die von ALS-Patienten mit zwei Sätzen von Antikörpern erhalten wurden, die Identifizierung des krankheitsspezifischen TDP-43 und seines phosphorylierten Derivats innerhalb der Proben.
Die Gesamt-TDP-43 könnte dann mit Hilfe der Kalibrierkurve quantifiziert werden. Und die intra- und inter-run Assay Variabilitäten wurden in gepoolten menschlichen ALS-Thrombozyten zytosolischen Fraktionen getestet. Diese Methode ermöglicht die Verwendung von primären Antikörpern und erleichtert die Identifizierung von bis zu fünf verschiedenen Zielproteinen innerhalb derselben Probe in einem einzigen Assay-Lauf.
Diese Technik reduziert nicht nur die Zeit der Proteinanalyse erheblich, sie erfordert Mikroliter-Probenvolumina und erzeugt Ergebnisse mit hoher Reproduzierbarkeit. Einige der chemikalienverwendeten Chemikalien, die in diesem Test verwendet werden, und alle menschlichen Proben gelten als biogefährlich, daher sollte bei diesen Experimenten immer eine geeignete persönliche Schutzausrüstung verwendet werden.
