このプロトコルは、単一のアッセイプレート内のタンパク質および一次抗体濃度の両方を最適化し、単一のサンプル調製物を使用して2つのアッセイを実行するために使用できます。この技術の主な利点は、データ分析を含む2 1/2日のラボ作業を3時間半で完了できることです。この技術は、ALS用の血液ベースのバイオマーカーを開発するための高スループットアッセイフォーマットを提供し、大規模な臨床試験を行うための理想的な方法です。
この方法は、疾患予後の間に標的タンパク質プロファイルに関する洞察を提供し、興味深い臨床試験の薬物の効果の監視を容易にすることができる。ALS患者および健康な被験者から100マイクロリットルのヒト血小板ライセートを採取した後、毛細管レイアウトおよびサンプル調製のための社内生成テンプレートを記入してください。サンプル混合調製表は動的であり、ソースから削除するボリュームの量を自動的に計算します。
すべてのアッセイ試薬を氷の上に置きます。室温に残る必要があります標準パックを除く。蛍光マスターミックスを調製するには、DTTの透明なチューブに40マイクロリットルの脱イオン水を加え、20マイクロリットルの10倍サンプルバッファーを加えます。
そして、調製された400ミリモルDTT溶液の20マイクロリットルを、アッセイキットからピンクのチューブに。ビオチン化された梯子を準備するために、16マイクロリットルの脱イオン水、10Xサンプルバッファーの2マイクロリットルおよび準備された400ミリモルDTT溶液の2マイクロリットルをキットに提供される白い管に加える。穏やかな混合の後、ラダー溶液を変性前に200マイクロリットルのPCRチューブに移します。
氷の上にチューブを置く前に、10Xサンプルバッファーの1.5マイクロリットルと148.5マイクロイオン水を600マイクロ遠心チューブと渦に加え、混合します。目的の抗体を直接、表に示されているように希釈剤に加え、ピペットチップを同種の抗体溶液で複数回洗い流します。キャピラリーサンプルミックスを調製するには、すべてのPCRチューブを開き、逆ピペット法を使用して表に示されているように、蛍光5Xサンプルバッファーの1.6マイクロリットルのアリコートを各チューブに加えます。
バッファーが追加されると、各チューブを直ちに閉じます。すべてのバッファーが追加されたら、すべてのチューブを開き、表に示されているように、ボリュームに 0.1X サンプル バッファーを追加し、バッファーが追加されると、各チューブをすぐに閉じます。次に、すべてのチューブを開き、表に示されているようにタンパク質サンプルを追加し、各チューブキャップをすぐに閉じます。
すべてのサンプルを追加したら、ベンチトップ遠心分離機のチューブをすべて簡単に遠心分離します。再び試料を混合し、遠心分離する渦。2回目の遠心分離の終わりに、すべてのチューブを熱い蓋をしたサーモサイクラーに入れます。
そして、示された条件下でサンプルを変性する。変性の終わりに、遠心分離機、ミックス、遠心分離を再びサンプルを混合し、氷の上のチューブラックにすべてのチューブを配置します。図をガイドとして使用し、ストレプトアビジン・ワサビペルオキシダーゼを10マイクロリットルウェルD1に加え、 ウェルD2からD5までの適切な二次抗体の10マイクロリットル、行Bの各ウェルに10マイクロリットルの抗体希釈液、およびウェルC1、ウェルC2からC25に適切な一次抗体の10マイクロリットル、PCRチューブ番号1からよくA1へのビオチン化ラダーの5マイクロリットル、A2からA25までの3マイクロリットルのサンプルと、正しい順序で小さな井戸にサンプルミックスと試薬をピペット処理する各ウェルに、作製したルミノール過酸化物の15マイクロリットルは、実験の成功に不可欠であるため、非常に慎重に行う必要があります。
その後、指定された各洗浄バッファーに500マイクロリットルの洗浄バッファーを追加します。そして、遠心分離によってプレートの内容物をスピンダウン。アッセイプレートでキャピラリー解析を実行するには、キャピラリーアナライザをオンラインシステムに接続し、アナライザーソフトウェアで[計測器と接続]をクリックします。
ポップアップメニューから計測器のシリアル番号を選択し、「接続」をクリックします。アッセイタブを選択し、新規アッセイを選択し、アッセイパラメータを入力してファイル名と場所を保存します。次に、アナライザーの点滅する青色インジケータが青で点灯していることを確認し、キャピラリーカートリッジをパッケージから取り外します。
アッセイプレートから保護シールを取り外し、気泡の事前充填されたウェルを目視で観察します。プレートホルダにアッセイプレートを置き、キャピラリーカートリッジを斜めに保持し、カートリッジをキャピラリースロットに挿入し、アナライザドアを閉めます。次に、アナライザー ソフトウェアで [開始] をクリックします。
アッセイで血小板リセート混合物全体を使用すると、標的タンパク質のシグナル強度を低下させ、高いバックグラウンドシグナルに寄与する可能性があります。従って、本アッセイでは、血小板を破裂させた後に透明上清を用いた。血小板サイトゾルタンパク質濃度の線形ダイナミックレンジを1ミリリットル当たり0.2~0.8ミリグラムに確立し、タンパク質濃度と一次抗体の滴定の両方を単一のアッセイで行うことができるように作文テンプレートを採用した。
高ダイナミックレンジ検出プロファイルは、キャピラリーアッセイの感度が高いため、大幅に広いダイナミックレンジを提供し、より大きなサンプル濃度範囲に対するより良い検出と定量をもたらします。個々の露光時間も定義できます。最適化アッセイ条件を用いて、2組の抗体を用いてALS患者から得られた血小板ライセート細胞種画分のこの分析により、疾患特異的TDP-43とそのリン酸化誘導体をサンプル内で同定することができます。
その後、合計TDP-43をキャリブレーション曲線を使用して定量化することができます。そして、イントラアッセイおよびインターランアッセイ変動性を、プールされたヒトALS血小板細胞体画分で試験した。この方法により、一次抗体を使用することができ、1回のアッセイで同じサンプル内で最大5つの異なる標的タンパク質の同定が容易になります。
この技術はタンパク質分析時間を大幅に短縮するだけでなく、マイクロリットルのサンプル量を必要とし、高度な再現性を持つ結果を生成します。このアッセイで使用される化学物質の一部とすべてのヒトサンプルは、生物的危険であると考えられるので、これらの実験を行う際には、適切な個人用保護具を常に使用する必要があります。
