使用分体路西酶测定系统识别 HBx-DDB1 相互作用的抑制剂

HBX-DDB1相互作用是促进从ccDNA进行HPV转录的关键步骤，因此该协议可能成为发现HPV功能治疗新治疗剂的关键资产。我们的程序很简单，只需很短的时间进行筛选。我混合的相互作用可以实时检测，而无需细胞解解。

此外，筛选质量令人满意，Z等分高。HBX-DDB1 相互作用的抑制导致 Smc5/6 的恢复，从而抑制 HPV 转录、蛋白质表达和 ccDNA 生产。这种新型的抗病毒作用机制可以克服目前HPV疗法的不足。

蛋白质-蛋白质相互作用是药物靶点的重要类别。此处描述的基于分裂-荧光酶的酸，针对病毒和有S蛋白之间的相互作用，可能为开发其他传染病的治疗方法提供一种新的策略。尽管我们的协议简单易懂，但如果没有可视化演示，某些步骤可能很难重现。

因此，可视化演示对理解我们的协议有很大的帮助。首先将5倍10至第5个 HEK293T 细胞播种到 100 毫米的培养皿中，并孵育在 37 摄氏度下过夜。第二天，稀释每微克的HBx-LgBit和SmBit-DDB1表达DNA质粒和DNA凝结缓冲液，总体积为300微升。

加入16微升增强剂溶液，通过涡流混合管一秒钟。在室温下孵育样品三分钟，然后加入60微升转染试剂。旋转管10秒钟，再孵育样品8分钟。

同时，用细胞从培养皿中吸出介质，用五毫升PVS洗涤。吸升PVS并添加7毫升DMEM。将三毫升DMEM加入导管，用转染复合物，上下移液器混合，并将混合物加入细胞中。

然后，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞10小时。孵育后，取出已花的培养培养，用五毫升PVS清洗细胞。在0.25%的尝试素EDTA的一毫升下取出PVS，并在37摄氏度下孵育细胞以分离它们。

接下来，加入四毫升DMEM，通过多次在细胞层表面移液来分散介质，并将悬浮液转移到管中。将细胞在500次G下离心5分钟，然后丢弃上最后一代，并在PVS的一毫升中重新悬浮细胞颗粒。重复四分法并丢弃上经剂。

然后，用缓冲细胞培养培养剂重新悬浮细胞颗粒，辅以10%FBS，使每毫升100万个细胞的种子密度。将50微升的细胞悬浮液放入96井板的每个井中，将细胞返回37摄氏度的培养箱10小时。当细胞孵育时，将筛选化合物和溶剂稀释至13.5 X浓度。

在每个井中加入12.5微升的发光基板，并在室温下孵育板5分钟。使用发光计测量基线亮度，并在后立即将化合物的五微升和受控的 DMSO 添加到每个井中。每30分钟测量一次发光两小时，然后计算与DMSO处理相比化合物的抑制作用。

测量了基线发光信号，计算信号与背景比大于80。Z 等数值大于 0.5，表明此检测系统可接受高通量筛选。通过将阈值设置为大于 40% 的抑制比与仅 DMSO 控制相比，硝基多糖胺被确定为候选药物。

我们之前通过用这种方法筛选反应性小规模化合物库，将硝氮氧化物确定为HBX-DDB1相互作用的抑制剂。使用硝基多糖酰胺，我们确认抑制HBX-DDB1相互作用，减少病毒转录，以及随后的病毒产品水平。必须事先确定分裂荧光素酶与目标蛋白质融合的最佳部分。

在这种情况下，HPX 在 HPX 的 C 终点与大位融合，DDB1 的末元位将 DDB1 的 DDB1 融合到小位，提供了最佳结果。