HBX-DDB1 etkileşimi cccDNA'dan HPV transkripsiyonuna teşvik etmek için çok önemli bir adımdır, bu nedenle bu protokol HPV fonksiyonel tedavisi için yeni terapötik ajanlar keşfetmek için önemli bir varlık haline gelebilir. Prosedürümüz basittir ve ekrana sadece kısa bir süre gerektirir. Karıştırdığım etkileşim hücre lisisi gerektirmeden gerçek zamanlı olarak tespit edilebilir.
Ayrıca, tarama kalitesi yüksek Z asal puanı ile tatmin edicidir. HBX-DDB1 etkileşiminin inhibisyonu Smc5/6'nın restorasyonuna yol açar ve bu da HPV transkripsiyonunun, protein ekspresyonunun ve cccDNA üretiminin bastırılmasına neden olur. Antiviral eylemin bu yeni mekanizması mevcut HPV tedavilerinin yetersizliklerinin üstesinden gelebilir.
Protein-protein etkileşimleri ilaç hedeflerinin önemli sınıfıdır. Burada açıklanan, viral ve hasS proteinleri arasındaki etkileşimleri hedefleyen split-luciferase bazlı asit, diğer bulaşıcı hastalıklar için tedavilergeliştirmek için yeni bir strateji sağlayabilir. Protokolümüz basit ve anlaşılması kolay olsa da, bazı adımları görsel gösteri olmadan çoğaltmak zor olabilir.
Böylece, görsel gösteri bizim protokol anlamak için büyük bir yardımcı olacaktır. 5. HEK293T hücrelerini 10 mililitre DMEM ile 100 milimetrelik bir tabağa beş kez 10 tohumlayarak ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırarak başlayın. Ertesi gün, toplam 300 mikrolitre hacim için DNA plazmidleri ve DNA yoğuşma tamponunu ifade eden HBx-LgBit ve SmBit-DDB1'in her birini bir mikrogram seyreltin.
Artırıcı çözelti 16 mikrolitre ekleyin ve bir saniye girdap tarafından tüpleri karıştırın. Numuneyi oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatırın, ardından 60 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Tüpü 10 saniye boyunca girdaplayın ve numuneyi sekiz dakika daha kuluçkaya yatırın.
Bu arada, hücreleri ile çanak orta aspire ve PVS beş mililitre ile yıkayın. PVS aspire ve DMEM yedi mililitre ekleyin. Transfeksiyon kompleksleri ile tüpe üç mililitre DMEM ekleyin, pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için, ve hücrelere karışımı ekleyin.
Sonra, hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın ve 10 saat boyunca %5 karbondioksit. Kuluçkadan sonra harcanan kültür ortamını çıkarın ve hücreleri beş mililitre PVS ile yıkayın. %0,25 tripsin EDTA'nın bir mililitresinde PVS'yi çıkarın ve hücreleri ayırmak için 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, dört mililitre DMEM ekleyin ve ortayı hücre tabakasının yüzeyine birkaç kez borulandırarak dağıtın ve süspansiyonu bir tüpe aktarın. Hücreleri 500 kez G'de beş dakika santrifüj edin, sonra süpernatant'ı atın ve hücre peletini bir mililitre PVS'de yeniden askıya alın. Cetrifugation tekrarlayın ve supernatant atın.
Daha sonra, mililitre başına bir milyon hücre bir tohumlama yoğunluğu% 10 FBS ile desteklenen tamponlu hücre kültürü orta ile hücre pelet yeniden askıya. Pipet, 96 kuyulu bir plakanın her kuyuya hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresi ve hücreleri 10 saat boyunca 37 derecelik kantine geri döndürün. Hücreler kuluçkaya yatarken, tarama bileşiklerini ve çözücüleri 13,5 X konsantrasyonuna seyreltin.
Her kuyuya 12,5 mikrolitre parlak substrat ekleyin ve tabağı oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Bir luminometre ile temel parlaklığı ölçün ve bileşiklerin beş mikrolitre ekleyin ve hemen sonra her bir iyi DMSO kontrollü. İki saat boyunca her 30 dakikada bir parlaklık ölçün, ardından DMSO tedavisiile karşılaştırıldığında bileşiklerin inhibitör etkilerini hesaplayın.
Temel parlaklık sinyalleri ölçüldü ve sinyal-arka plan oranı 80'den büyük olarak hesaplandı. Z asal 0,5'ten büyüktü ve bu da bu deneme sisteminin yüksek işlem li tarama için kabul edilebilir olduğunu gösteriyordu. DMSO sadece kontrolü ile karşılaştırıldığında% 40'tan fazla inhibisyonu için eşik ayarlayarak, nitazoxanide bir aday ilaç olarak tespit edildi.
Daha önce bu yöntemle bir reaktivite küçük ölçekli bileşik kütüphane taranarak HBX-DDB1 etkileşiminin bir inhibitörü olarak nitazoxanide tespit. Nitazoxanide kullanarak HBX-DDB1 etkileşiminin inhibisyonu, viral transkripsiyonun azaltılması ve sonraki viral ürün düzeylerinin azaldığını doğruluzduk. Bir hedef proteine kaynaşmış bölünmüş luciferase optimal kısmı önceden belirlenmelidir.
Bu durumda HPX, HPX'in C terminusu olan Large Bit'e ve DDB1'in son terminusunda Small Bit'e kaynaşmış olarak erimiş ve en iyi sonuçları vermiştir.
