L'interazione HBX-DDB1 è un passo cruciale per promuovere la trascrizione HPV da cccDNA, quindi questo protocollo può diventare una risorsa chiave per scoprire nuovi agenti terapeutici per la cura funzionale HPV. La nostra procedura è semplice e richiede solo un breve tempo per lo schermo. L'interazione che mescolo può essere rilevata in tempo reale senza richiedere lisi cellulare.
Inoltre, la qualità dello screening è soddisfacente con un punteggio primo Z elevato. L'inibizione dell'interazione HBX-DDB1 porta al ripristino di Smc5/6, che si traduce nella soppressione della trascrizione HPV, dell'espressione proteica e della produzione di cccDNA. Questo nuovo meccanismo di azione antivirale può superare le inadeguatezze delle attuali terapie HPV.
Le interazioni proteina-proteina sono un'importante classe di bersagli farmacologici. L'acido a base di split-luciferasi qui descritto, che prende di mira le interazioni tra proteine virali e hasS, può fornire una nuova strategia per sviluppare cure per altre malattie infettive. Sebbene il nostro protocollo sia semplice e facile da capire, alcuni passaggi potrebbero essere difficili da riprodurre senza la dimostrazione visiva.
Pertanto, la dimostrazione visiva sarà di grande aiuto per comprendere il nostro protocollo. Inizia seminando cinque volte 10 fino alla 5 ° cellule HEK293T in un piatto da 100 millimetri con 10 millilitri di DMEM e incubandoli durante la notte a 37 gradi celsius. Il giorno successivo, diluire un microgrammo ciascuno di HBx-LgBit e SmBit-DDB1 esprimendo plasmidi di DNA e tampone di condensazione del DNA per un volume totale di 300 microlitri.
Aggiungere 16 microlitri di soluzione di esaltatore e mescolare i tubi vortice per un secondo. Incubare il campione a temperatura ambiente per tre minuti, quindi aggiungere 60 microlitri di reagente di trasfezione. Vortice il tubo per 10 secondi e incubare il campione per altri otto minuti.
Nel frattempo, aspirare il mezzo dal piatto con le cellule e lavarle con cinque millilitri di PVS. Aspirare il PVS e aggiungere sette millilitri di DMEM. Aggiungere tre millilitri di DMEM al tubo con i complessi di trasfezione, pipettare su e giù per mescolare e aggiungere la miscela alle cellule.
Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per 10 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo di coltura trascorso e lavare le cellule con cinque millilitri di PVS. Rimuovere il PVS con un millilitro dello 0,25% di tripside EDTA e incubare le cellule a 37 gradi celsius per staccarle.
Successivamente, aggiungere quattro millilitri di DMEM e disperdere il mezzo tubazione più volte sulla superficie dello strato cellulare e trasferire la sospensione su un tubo. Centrifugare le cellule a 500 volte G per cinque minuti, quindi scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in un millilitro di PVS. Ripetere la cetrifugazione e scartare il supernatante.
Quindi, sospendere nuovamente il pellet cellulare con un mezzo di coltura cellulare tamponato integrato con 10%FBS a una densità di semina di un milione di cellule per millilitro. Pipettare 50 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra di 96 po 'e riportare le cellule all'incubatore di 37 gradi celsius per 10 ore. Mentre le cellule stanno incubando, diluire i composti di screening e il solvente alla concentrazione del 13,5%.
Aggiungere 12,5 microlitri di substrato luminescente ad ogni pozzo e incubare la piastra per cinque minuti a temperatura ambiente. Misurare la luminescenza di base con un luminometro e aggiungere cinque microlitri dei composti e del DMSO controllato a ciascun pozzo immediatamente dopo. Misurare la luminescenza ogni 30 minuti per due ore, quindi calcolare gli effetti inibitori dei composti rispetto al trattamento DMSO.
Sono stati misurati i segnali di luminescenza di base e il rapporto segnale-sfondo è stato calcolato essere maggiore di 80. Il primo Z era maggiore di 0,5, indicando che questo sistema di dosaggio è accettabile per lo screening ad alta produttività. Impostando la soglia su un'inibizione superiore al 40% rispetto al controllo solo DMSO, il nitazoxanide è stato identificato come un farmaco candidato.
In precedenza abbiamo identificato il nitazoxanide come un inibitore dell'interazione HBX-DDB1 vagliando una libreria composta su piccola scala di reattività con questo metodo. Usando il nitazoxanide, confermiamo che l'inibizione dell'interazione HBX-DDB1, quella riduzione della trascrizione virale e i successivi livelli di prodotto virale. La porzione ottimale della luciferasi divisa fusa a una proteina bersaglio deve essere determinata in anticipo.
In questo caso, HPX fuso a Large Bit al capolinea C di HPX e DDB1 fuso a Small Bit al termine finale di DDB1 ha fornito i migliori risultati.
