反义寡核苷酸临床试验中DMD患者样本的Exon跳过效率特征

该协议为在临床前设置和临床试验中准备和处理肌肉组织的标准化方法提供了标准化的方法，这对在 DMD 领域获得可靠的结果非常重要。这些技术与 exon 跳过 Dmd 的试用有关。主要优点是，如果集体实施，它们就已建立良好，可重复。

这些技术主要侧重于在DMD中跳过，但随着底像的改变，同样的技术可以应用于其他疾病治疗拼接疗法。这些方法可用于实现 exon 跳过效率以及 RNA 和蛋白质。要准备样品进行分析，首先混合等量的牙龈和水，直到口香糖变得柔软和粘稠。

将这种混合物装入25毫升注射器，将0.5至1厘米的口香糖滴到单独的软木盘上。将圆盘贴上相反的标记，并在液氮中放置一个异丙烷容器，直到部分液体结冰。将每个标本放入圆盘上的牙龈中，用垂直于软木塞的每个肌肉的纵向轴。

将口香糖放在每个肌肉的底部，以帮助保持肌肉到位，并使用钳子冻结在冷异丙烷的标本。连续移动试样一分钟或直到完全冻结，然后再将其暂时放在干冰上。然后，将样品放在玻璃瓶中，储存80摄氏度。

要将冷冻肌肉组织进行剖面分析，请将低温恒温设置为 25 摄氏度的工作温度，然后将肌肉块安装到支架上。修剪组织块，直到达到平坦的截面。对于逆转录酶PCR和西印迹分析，获得10微米厚片。

用于免疫石化学分析，获得6至8微米厚的切片，对于血氧素和eosin染色，获得10至12微米厚的切片。采集后，将切片部分放在两毫升管中。将 PCR 和西印的样品储存在 80 摄氏度。

在这里，微芯片电泳系统，逆转录酶PCR反应的凝胶图像，以及两名患者在剂量升级阶段试验中使用反义寡核苷酸治疗前和治疗后跳过带的测序结果。两个患者都怀有删除。正如预期的那样，在治疗之前，两个患者都没有表现出跳过，只有一个非跳过带可以可视化。

经过12周的治疗，第二个病人的明显跳过下带被可视化，但是，仍然很难检测出任何跳过的产品为第一个病人。测序结果显示，第二名患者的外显子47和54与第一名患者的外显子44和54的串联。为了计算跳过的百分比，跳过波段的摩尔浓度除以跳过带和未跳过带。

不出所料，在治疗前，西方印迹未检测到肌营养不良素带。治疗后，与第一位在健康控制中观察到的分子量较低的患者相比，检测到一个带状物。然而，第一个患者在治疗后没有表现出可检测的营养不良水平。

正确处理肌肉组织，并始终如一地将每个标本放在牙龈上至关重要。组织部分可以通过多种不同方式进行分析，包括人工到PCR、数字PCR、西印、免疫组织化学以及不同类型的组理。这些技术可以加速， 开发， 额外的 exon 跳过药物针对不同的 exons， 并可以应用于基于病毒的发展， 并再次编辑 DMD.