微生物通过微血管内皮细胞对血脑屏障渗透性分析

这种方法通过测量不同治疗的细菌遍历，可以分析人类血脑屏障。它可能有助于发现细菌性脑膜炎和术后精神错乱的发病机制。这是一种简单明了的方法，治疗的效果直接表现为细菌的数量。

它可以被修改，以便对内皮细胞上的化合物进行高通量分析。首先将 12 井板组装在生物安全柜中。拆开板和每个刀片，然后使用消毒钳抓住其底部的刀片，并把它们放入井中。

在每个刀片的多孔膜上涂上90微升，每微升胶原蛋白IV和纤维素混合物10微克，并在37摄氏度的细胞培养箱中孵育板，24小时。孵育后，将一毫升PBS移液到每个刀片中，用真空泵吸气，将刀片洗涤两次。然后通过上下腔中预预热的DMEM F12介质对膜进行平衡，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板。

播种人类微血管内皮细胞，从细胞培养瓶中吸出培养的培养，用10毫升PBS清洗细胞。用5毫升的尝试性EDTA完全覆盖细胞，并在37摄氏度下孵育烧瓶3至5分钟。将5毫升细胞转移到15毫升管中，并加入5毫升含有介质的FCS，以停止酶反应。

在210倍g下离心3分钟，取出上光，将细胞颗粒重新悬浮在5毫升的介质中。将10微升的细胞悬浮液加入10微升0.4%的尝试蓝色污渍，然后将10微升的混合物加入计数室。将计数室放入单元格计数器，然后启动相应的程序，确保计数器已聚焦。

数了之后，种子20万细胞进入12井板的每个上腔，并在37摄氏度下孵育板，每两到三天改变上腔室和下室的介质。14天后，通过显微镜成像，确保细胞汇合度为100%。在渗透性测量前一天，将大肠杆菌菌株 GM2163 放入三毫升 LB 介质中。

在37摄氏度的孵化摇床中培养细胞24小时。要用感兴趣的化合物治疗细胞，将其稀释到DMEM F12介质中的最终浓度，并将这种混合物加入12井板的上腔和下腔，然后在细胞培养培养箱中孵育该细胞。孵育后，用无抗生素介质交换完整的介质。

通过测量其光学密度在600纳米，然后稀释到50毫升猎鹰管中的0.5的OD600的OD600，确定隔夜细菌培养物的浓度。在生物安全柜中，将450微升的细菌溶液加入12井板的每个上腔，然后在37摄氏度下孵育6小时。孵育后，用钳子取出刀片，并将介质的样品从每个下腔中取出50微升，注意不要将介质从上腔溢出到下室。

必须严格区分上下室的介质，因为从上室细菌的溢出会导致误报结果。将每个样品放到单独的加糖板上，用细胞扩散器条纹溶液。在37摄氏度下孵育板24小时，然后计算菌落。

为了研究糖化对通过血脑屏障的微生物穿越的影响，细胞用0.5和0.15毫摩尔糖溶液治疗了一个小时，未经处理的细胞作为对照。然后通过免疫印迹与抗年龄抗体检测糖化。获得的细菌菌落被计算为绝对菌落数量或与控制结果正常化的相对菌落数。

用甘于一氧化二甲处理的样本显示，菌落数量增加，表明该治疗对细胞屏障密度有一些影响。为了研究葡萄糖诱导蛋白糖化，在正常葡萄糖和高葡萄糖介质中培育了THBMEC。菌落的绝对数量和与对照相对的菌落数量表明，葡萄糖对血脑屏障的完整性没有显著影响。

通过蛋白质组学方法（例如质谱法）可以进一步分析经过治疗的内皮细胞，以分析蛋白质组的变化。这种技术有助于理解人类血脑屏障和细菌穿越。它可用于发现衰老和神经退行性疾病的各个方面，如阿尔茨海默病。