Bu yöntem, farklı tedaviler üzerine bakteriyel geçiş ölçerek insan kan-beyin bariyerini analiz etmek mümkün kılar. Bakteriyel menenjit ve postoperatif deliryum patogenezini keşfetmeye yardımcı olabilir. Bu basit bir yöntemdir ve tedavinin etkileri doğrudan bakteri sayısı ile temsil edilmektedir.
Endotel hücrelerindeki bileşiklerin yüksek iş analizini sağlamak için değiştirilebilir. 12 kuyulu plakayı biyolojik bir güvenlik kabinine monte ederek başlayın. Plakayı ve her kesici ucu boşaltın, daha sonra tabanındaki kesici uçları kapmak ve kuyulara koymak için sterilize edilmiş forceps kullanın.
Her kesici niçin 90 mikrolitre mikrolitre mikrolitre kollajen IV ve fibronektin karışımı ile gözenekli membran katlayın ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede bir hücre kültürü kuluçka plaka kuluçka. Kuluçkadan sonra, kesici uçları her kesici uça bir mililitre PBS boru sulayarak ve vakum pompası ile azarlayarak iki kez yıkayın. Daha sonra üst ve alt bölmelerde önceden ısınmış DMEM F12 ortamını borulandırarak membranları dengeleyin ve plakayı 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.
Insan mikrovasküler endotel hücrelerini tohumlamak için, hücre kültürü şişeden orta aspire ve PBS 10 mililitre ile hücreleri yıkayın. Hücreleri beş mililitre tripsin EDTA ile kaplayın ve şişeyi 37 santigrat derecede 3-5 dakika kuluçkaya yatırın. Hücrelerin beş mililitresini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için orta içeren beş mililitre FCS ekleyin.
210 kez g üç dakika süspansiyon santrifüj, supernatant çıkarın ve orta beş mililitre hücre pelet askıya. Hücre süspansiyon10 mikrolitre ekleyin 10 mikrolitre 0.4% trypan mavi leke, sonra bir sayma odasına karışımın 10 mikrolitre ekleyin. Sayma odasını hücre sayacına koyun ve sayacın odaklandığınızdan emin olmak için uygun programı başlatın.
Saydıktan sonra, tohum 200, 000 hücreleri 12-iyi plaka üzerinde her üst odaya ve 37 derece santigrat 14 gün boyunca üst ve alt odasında her iki ila üç gün medya değiştirerek plaka kuluçka. 14 gün sonra, mikroskopla görüntüleyerek hücre birleşiminin %100 olduğundan emin olun. Geçirgenlik ölçümünden bir gün önce, bir kolonie G.COL Orta Üç mililitre içine E.coli süzme GM2163 koyun.
37 derecedeki hücreleri kuluçka da 24 saat boyunca kültür. Hücreleri ilgi çekici bir şekilde tedavi etmek için, DMEM F12 ortamındaki son konsantrasyonuna seyreltin ve bu karışımı 12 kuyulu plakanın üst ve alt odalarına ekleyin, sonra da bir hücre kültürü kuluçka makinesinde plakayı kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, antibiyotiksiz orta ile tam orta değişimi.
Optik yoğunluğunu 600 nanometre de ölçerek bir gecede bakteri kültürünün konsantrasyonunu belirleyin, sonra 50 mililitrelik Falcon tüpünde 0,5 od600'e seyreltin. Biyolojik bir güvenlik kabininde, 12 kuyulu plakanın her bir üst haznesine 450 mikrolitre bakteri çözeltisi ekleyin, sonra tabağı 37 santigrat derecede altı saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, kesici uçlarla kesici uçları çıkarın ve ortanın 50 mikrolitresini her alt odadan alın ve ortayı üst odalardan alt odalara dökmemeye özen inin.
Üst ve alt odanın ortamını, üst odanın bakterilerinden dökülmesi yanlış pozitif sonuçlara yol açacağı ndan, kesinlikle ayırmak önemlidir. Her numuneyi ayrı bir agar plakasına bırakın ve çözeltiyi bir hücre dağıtıcısıyla çizgiye yerleştirin. Plakaları 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın, sonra da kolonileri sayın.
Kan-beyin bariyerinden geçerek mikrobiyal geçiş üzerindeki glisasyon etkisini araştırmak için, hücreler bir saat boyunca 0.5 ve 0.15 milibüler glyoxal solüsyon ile tedavi edildi tedavi edilmemiş hücreler bir kontrol görevi gördü. Glisasyon daha sonra anti-AGE antikorları ile immünoblotting yoluyla tespit edildi. Elde edilen bakteri kolonileri sayıldı ve mutlak koloni sayısı veya kontrole normalleştirilen kolonilerin göreceli sayısı olarak temsil edildi.
Glyoxal ile tedavi edilen örnekler, tedavinin hücresel bariyer yoğunluğu üzerinde bir etkisi olduğunu gösteren kolonisayısının arttığını gösterdi. Glikoza bağlı protein glisasyonu araştırmak için THBMEC'ler normal glikoz ve yüksek glikoz lu ortamda yetiştirildi. Mutlak koloni sayısı ve kontrole normalleştirilen kolonilerin göreceli sayısı glikozun kan-beyin bariyerinin bütünlüğü üzerinde önemli bir etkisi olmadığını göstermiştir.
Tedavi edilen endotel hücreleri proteomdaki değişiklikleri analiz etmek için proteomik yaklaşımlarla, örneğin kütle spektrometresi ile daha fazla analiz edilebilir. Bu teknik insan kan-beyin bariyeri ve bakteriyel geçiş anlamada yardımcı olur. Bu Alzheimer hastalığı gibi yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıkların yönlerini keşfetmek için kullanılabilir.
