이 방법은 다른 처리에 세균성 횡단을 측정해서 인간 적인 혈액-두뇌 장벽을 분석하는 가능하게 합니다. 그것은 세균성 뇌막염과 수술 후 정신 착란의 병인을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 간단한 방법이며 치료의 효과는 박테리아의 수에 의해 직접 표현된다.
내피 세포상에 있는 화합물의 높은 처리량 분석을 가능하게 하기 위하여 변형될 수 있다. 생물학적 안전 캐비닛에 12웰 플레이트를 조립하여 시작합니다. 플레이트와 각 인서트를 풀고 멸균 된 집게를 사용하여 베이스의 인서트를 잡고 우물에 넣습니다.
각 인서트의 다공성 멤브레인을 마이크로리터 콜라겐 IV 당 10 마이크로리터의 90 마이크로리터와 섬유네틴 혼합물로 코팅하고 24시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다. 인큐베이션 후, 각 인서트에 PBS의 1 밀리리터를 파이프로 파이프하고 진공 펌프로 흡입하여 인서트를 두 번 세척합니다. 그런 다음 상부 및 하부 챔버에서 예동DMEM F12 배지를 배관하여 멤브레인을 양립하고 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %에서 플레이트를 배양합니다.
인간 미생물 내피 세포를 종자하기 위해, 세포 배양으로부터 배지를 흡인하고 PBS의 10 밀리리터로 세포를 세척한다. 트립신 EDTA의 5 밀리리터로 세포를 완전히 덮고 플라스크를 섭씨 37도에서 3~5분 동안 배양합니다. 세포의 5 밀리리터를 15 밀리리터 튜브로 옮기고 효소 반응을 막기 위해 배지를 함유한 FCS의 5밀리리터를 추가합니다.
210회 g에서 3분 동안 서스펜션을 원심분리하고, 상류체를 제거하고, 5밀리리터의 배지에서 세포 펠릿을 재연한다. 세포 현탁액의 마이크로리터 10을 0.4%의 트라이팬 블루 스테인 10마이크로리터에 추가한 다음, 10마이크로리터의 혼합물을 카운팅 챔버에 추가합니다. 셀 카운터에 계수 챔버를 넣고 카운터가 집중되도록 적절한 프로그램을 시작합니다.
카운트 후, 종자 200, 000 세포는 12 웰 플레이트에 각 상부 챔버로 플레이트를 배양하고 2 ~ 3 일마다 상부 및 하부 챔버에서 미디어를 변경 14 일 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양한다. 14 일 후에, 세포 결합이 현미경으로 그(것)들을 화상 진찰해서 100%이다는 것을 확인하십시오. 투과성 측정 하루 전에, E.coli 균주 GM2163의 한 식민지를 LB 매체의 3 밀리리터에 넣습니다.
인큐베이션 셰이커에서 24시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 관심있는 화합물로 세포를 치료하려면 DMEM F12 배지의 최종 농도로 희석하고 12 웰 플레이트의 상부 및 하부 챔버에이 혼합물을 추가 한 다음 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션 후, 항생제가 없는 배지로 전체 배지를 교환한다.
600 나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 하룻밤 세균 배양의 농도를 결정한 다음 50 밀리리터 팔콘 튜브에서 0.5의 OD600으로 희석합니다. 생물학적 안전 캐비닛에서 세균용 용액 450마이크로리터를 12웰 플레이트의 각 상부 챔버에 추가한 다음 섭씨 37도에서 6시간 동안 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션 후, 상부 챔버에서 배지를 하부 챔버로 유출하지 않도록 주의각 하부 챔버에서 매질의 집게와 샘플 50 마이크로리터를 삽입하고 샘플링한다.
상부 챔버의 박테리아로부터 유출이 거짓 양성 결과로 이어질 것이기 때문에 상하부의 미디어를 엄격하게 분리하는 것이 중요합니다. 각 샘플을 별도의 한고 플레이트에 떨어뜨리고 셀 스프레더로 용액을 줄입니다. 24 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양 한 다음 식민지를 계산합니다.
혈액-뇌 장벽을 통해 미생물 횡단에 대한 당화의 효과를 조사하기 위해 세포는 대조군역할을 하는 처리되지 않은 세포로 1시간 동안 0.5 및 0.15 밀리머 글리옥살 용액으로 처리되었다. 글리세이션은 항AGE 항체를 가진 면역 블로팅을 통해 검출되었다. 얻어진 세균성 식민지는 식민지의 절대 수 또는 대조군으로 정규화된 식민지의 상대적인 수로 계산되고 표현되었다.
글리옥살로 치료된 샘플은 치료가 세포 장벽 밀도에 영향을 미친다는 것을 나타내는 콜로니의 수가 증가했습니다. 포도당 유발 단백질 당화를 조사하기 위해 THBMEC는 정상 포도당 및 고혈당 배지에서 재배되었습니다. 식민지의 절대 수와 대조군으로 정상화된 식민지의 상대적인 수는 포도당이 혈액-뇌 장벽의 무결성에 큰 영향을 미치지 않았다는 것을 나타냈다.
처리된 내피 세포는 프로테오메의 변화를 분석하기 위하여 프로테오믹스 접근법, 예를 들어 질량 분석법에 의해 더 분석될 수 있다. 이 기술은 인간의 혈액-뇌 장벽과 세균성 횡단을 이해하는 데 도움이됩니다. 그것은 노화와 알 츠 하이 머 병 등 신경 퇴행 성 질환의 측면을 발견 하는 데 사용할 수 있습니다.
